QTL分析方法及其在水稻环境胁迫相关性状上应用的研究进展
[摘要]本文介绍了QTL定位的原理和方法；综述了水稻在环境胁迫下的生理表现及QTL分析在水稻环境胁迫相关性状上应用的研究进展。
[关键词]水稻 环境胁迫 数量性状基因(QTL)
1 QTL定位的原理和方法
数量性状基因定位（Quantitative Trait Loci mapping ，QTL定位），实质上就是确定与数量性状基因座位相连锁的分子标记及其在染色体上的位置并对遗传效应进行分析，QTL定位的基本过程是先选择具有极端相对性状的两个纯系亲本杂交构建一个合适的作图群体，然后通过分析DNA标记基因型和数量性状的表型值之间的相互关联，找到决定表型性状的各个QTL，并将其逐一定位在染色体上的相应位置，最后估算其QTL效应。
1.1 水稻DNA分子标记连锁图的构建
QTL的定位依赖于高密度分子标记连锁图的构建、适宜的遗传群体的发展和合适的统计模型与方法的应用。水稻遗传图谱的构建较早受到重视并取得较大进展。1994年Causse等人构建了包含816个标记的连锁图[1]；1998年Harushma等发表的连锁图上包含2275个标记[2]；目前Yano等构建的连锁图上有3267个标记，其中绝大多数为限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism , RFLP）标记，并且几乎都被转换成了切割长度多态性标记。水稻基因组测序已经完成，这将为水稻基因组研究提供更多的标记[3,4]。目前的数据表明水稻遗传图谱上的分子标记数已超过6000个，平均间距为75-100kb，基本覆盖了水稻基因组的所有区域。另外，美国康乃尔大学构建了水稻微卫星标记连锁图，图上的微卫星标记已达2740多个。
1.2 定位群体
目前常用的QTL定位群体一般是由两个纯系亲本杂交产生的F1代发展而来的。早期的QTL定位使用的多为暂时性分离群体，对于自花授粉作物常用的有F2F3等。这类群体构建容易，不需要很长时间，但是也有其局限性，一是每一个体的后代都可发生分离，不能进行多点多年的重复试验；二是表型鉴定以单株为基础，缺乏准确性。克服这两个缺点的途径是发展永久性分离群体，如加倍单倍体群体（DH群体）和重组自交系群体（RIL群体）。加倍单倍体群体是由花粉培养形成的，在花粉培养过程中可能受基因型选择的影响，群体构建难度较大。重组自交系群体是经过多代连续自交形成的，需要很长时间，但它们的一个显著特征是群体中每一个体其后代稳定不发生分离。
1.3 定位方法
利用DNA标记进行QTL定位的遗传学原理是：当分子标记与某一性状的QTL连锁时，不同标记基因型的个体的表现型将存在显著差异，分析这种差异，就可推断与分子标记相连锁的QTL的位置和效应。以DNA标记为基础的QTL分析方法主要有以下几种：一、单标记的定位方法；早期的QTL定位多采用这种方法，它不需要完整的分子标记连锁图，是将数量性状与标记联系起来最简单的方法。但它无法估计QTL的确切位置和准确效应。二、区间作图法；针对单标记定位方法的不足，Lander和Botstein提出基于最大似然分析原理的区间作图法，这种方法借助于完整的分子标记连锁图，计算基因组任意位置上两个相邻标记之间是否存在QTL的似然比的对数（LOD值），LOD值一般在2-3之间，QTL的位置可用LOD支持区间表示出来。区间作图法曾被认为是构建QTL图谱的标准方法，但它一次只用到两个标记进行检测，染色体上的其它标记信息未被利用，容易带来偏差。三、复合区间作图法；此方法在极大似然分析中引入多元回归模型，使一个被检测标记区间内任一位点上的检测在统计上不受该区间之外的QTL的影响，在一定程度上消除背景遗传变异的干扰，提高了QTL分析的可靠性和精确性。四、多区间作图法；这种方法也是以极大似然分析法估算遗传参数，同时利用多个标记区间对多个QTL进行作图，使QTL作图的精确度和有效性得到提高。五、混合线性模型方法；上述各种方法都是建立在简单的数量遗传模型基础之上，而实际上数量性状非常复杂，它除了受加性、显性效应控制外，还受上位性效应、基因型与环境互作效应等诸多因素的影响。为了分析和处理这种复
杂的遗传现象，朱军等最先将混合线性模型应用于QTL定位中，创立了混合模型的
复合区间作图法。这种方法将所有QTL主效应和QTL与环境的互作效应拟合在混合线性模型中，将效应分析和定位分析结合起来，进行多环境下的QTL定位，可以分析各种复杂的遗传效应和QTL与环境的互作效应，提高了作图的精确度和效应。
2 水稻环境胁迫下相关性状的研究
2.1 环境胁迫下水稻植株的生理表现
水稻是我国的主要粮食作物，受不同地理位置和环境的影响，在水稻整个生育期中，其是在不同的环境胁迫下生长至成熟，而这些环境胁迫包括：干旱、冻害、冷害、高温、淹涝、土壤酸碱度、病原微生物和紫外线等。水稻在干旱胁迫下会导致细胞膜结构遭到破坏，生长受到抑制，呼吸作用急剧变化，内源激素代谢失调，核酸代谢受到破坏，光合作用减弱。干旱导致植物光合作用减弱是作物减产的一个重要原因。通常认为干旱影响光合作用主要是通过气孔限制和非气孔限制两个因素造成的。干旱明显降低了植株的净光合速率，使叶绿体超微结构损坏，叶绿素降解从而含量降低，还可降低光合酶RuBP羧化酶和碳酸酐酶等活性。土壤盐分过多，特别是易溶解的盐类过多时，易使植株吸水困难，生物膜被破坏。在高温环境下，植株会出现各种热害病症：树干干燥裂开，叶片出现死斑，叶色变黑变黄，出现雄性不育，花序或子房脱落等异常现象。而冷害导致胞质环流减慢或停止，水分代谢失调，光合速率减弱，呼吸速率时强时弱。
淹涝对水稻生产的影响已引起了国内外研究学者的的广泛关注和高度重视。水稻在淹水缺氧条件下，呼吸和有机物合成代谢严重受阻，需消耗大量呼吸基质，体内碳水化合物及可溶性糖明显减少，养分供应短缺，导致部分茎蘖枯萎，甚至死亡。存活茎蘖也发生叶片枯萎，绿叶面积减少，根系活力低，叶绿素ａ、ｂ比值下降，叶质变劣，严重影响排水后的植株生长恢复，导致株高变矮、生育期推迟、无效穗和空秕粒增多、千粒重低，减产显著[5-9]。
2.2 环境胁迫下相关性状QTL分析研究进展
随着分子标记的发展，QTL分析已广泛的应用于数量性状的研究中，特别是对于水稻环境胁迫下的相关性状研究较多。胡颂平等[10]对正常与水分胁迫下水稻叶片叶
绿素含量进行QTL分析，研究表明叶绿素含量与光合速率在正常供水下呈极显著正相关(r=0.1857 )，但在干旱下则表现无关(r=0.0766)。QTL定位共检测到13个影响叶
绿素含量的主效QTL，分别位于第1、2、3、4、5、6、10染色体；其中在干旱处理下检测到6个，其联合贡献率为47.39%；在正常供水下检测到7个，联合贡献率达56.19%。检测到显著互作效应位点16对，其中干旱处理下有4对显著互作，联合贡献率为18.57%；正常供水下有12对显著互作,联合贡献率达38.49%。
沈圣泉等[11]用珍汕97B/密阳46构建的RIL群体及其遗传图谱，对其种子采用沙培法育苗和培养，试验设置2个高浓度(100mg/L和200mg/L)Cu2+胁迫处理，以处理20d后的幼苗相对根长(%)和相对苗高(%)作为苗期耐Cu2+胁迫指标，并用于QTL定位分析。结果表明，试验共检测到苗期耐Cu2+胁迫的主效应QTL 4个，以相对根长为指标，检测到qRCC(r)6(100mg/L)和qRCC(r)9(200mg/L)，以相对苗高为指标，也检测到qRCC(r) 1-2(100mg/L和200mg/L)和qRCC(r)6-1(200mg/L)，有效基因分散于双亲中。试验还检测到苗期耐Cu2+胁迫的上位性互作8对，以相对根长为指标时，检测到2对互作；以相对苗高为指标时，检测到6对上位性互作。表明水稻苗期耐高浓度Cu2+胁迫，其上位性互作也起到较为重要作用。
韩龙植等[12]以籼粳交密阳23/吉冷1号200个F2：3家系作为作图群体，在北京（正常生长环境）、昆明（自然低温胁迫）、公主岭（冷水胁迫）、韩国春川（正常生长环境和冷水胁迫）等5种不同生长环境下进行了水稻秆长、穗长、穗粒数和穗抽出度等主要农艺性状的异地鉴定，并利用SSR标记进行了上述农艺性状的QTL分析。检测结果表明，5种不同环境下检测到与上述农艺性状相关的QTL共44个，分布于除第9染色体外的11条染色体上。qCL1a、qCL1b、qCL5aqCL6b、qPL1a、qPL3a、qPL6b、qPL6c、qPL7b、qSP8b、qSP1c、qSP11a、qSP12 和qPE1 至少在2种不同生长环境下均检测到，受环境的影响较小，为较稳定的QTL。其中，qCL1a、qCL1b、qPL1a、qSP1c和qPE1 对表型变异的解释率分别为24.2%～55.2%、22.7%～39.9%、12.5%～27.7%、14.4%～33.5%和26.6%～28.7%，为主效基因，主要表现为超显性。这些主效QTL 在低温环境下对水稻秆长、穗长、穗粒数和穗抽出度有增效作用，与水稻耐冷性有一定的相关性。
龚继明等[13]利用127个稳定的DH株系构建的图谱，在盐胁迫环境与非盐胁迫环
境下分别调查了水稻5个重要的 农艺性状，总共检测到24个QTL，分别在除第9，11号染色体手上。盐胁迫环境中检测出了9个QTL，占总数的37.5％；非盐胁迫环境中则检测到17个QTL，占总数的70.8％；有两个QTL在两种环境中都检测到，
占总数的8.3％，它们分别是位于第4染色体上控制抽穗期的QTL和位于第6染色体上控制每穗粒数的QTL。此外，还检测出3个包含多个QTL的区间，它们分别位于第1，4和8染色体上，其中第一染色体上RG612分之标记附近检出2个QTL，在盐胁迫环境和非盐胁迫环境中分别控制有效分蘖和抽穗期这两个重要的农艺性状，其加性效应均由来源于JX17的等位基因提供。他们通过对水稻在盐胁迫环境和非盐胁迫环境下的 QTL对比研究，发现水稻第8染色体上几个控制水稻重要农艺性状的QTL明显受盐胁迫的影响。
T.TOOJINDA等[14]用RIL群体对淹涝处理后的植株叶绿素含量进行QTL分析，检测到的4个QTL分别位于第5、7、9、10染色体。国内李阳生[15-18]等研究认为水稻耐淹涝特性是数量性状，由5对基因控制。他们在水稻单核花粉形成期，通过穗茎注射将禾稗E.crugalli的总DNA导入到圭630和科成早3号，培育成耐淹品种94D-22和94D-05。他们同时认为水稻耐淹涝能力跟不同的生育阶段有关系，分蘖期耐淹能力较差，其它各阶段耐淹能力较高[19,20]，因此在苗期筛选高耐淹种质，提高苗期水稻的耐淹能力是选育耐淹品种的关键。
参考文献
[1] CAUSSE M A.FUL TON T M.CHO Y G. et al. Saturated molecular map of the rice genome based on an interspecific backcross population.Genetics,1994,138:251-274.
[2] HARUSHMA Y.YANO M.SHOMURA A. et al. A high density rice genetic linkage map with 2275 markers using a single F2 population.Genetics,1998,148:479-494.
[3] YU J. HU S. WANG J. et al. A draft sequence of the rice genome; Oryza sativa L. ssp. Indica. Science,2002,296:79-92.
[4] GOFF SA. RCKED, LAN T H. et al. A draft sequence of the rice genome; Oryza sativa L. ssp. Japonica. Science,2002,296:92-100.
