莫荚黄芪苯丙氨酸解氨酶在大肠杆菌中的表达和纯化
莫荚黄芪苯丙氨酸解氨酶在大肠杆菌中的表达和纯化
摘要:为了解膜荚黄芪苯丙氨酸解氨酶(AmPAL)基因的功能及生物活性,用基因重组技术构建了pQE30-
AmPAL原核表达载体,在大肠杆菌M15中表达和纯化融合蛋白,并对其进行PAL酶活性测定.结果表明,成
功地构建了pQE30-AmPAL原核表达载体,并在大肠杆菌大量表达,表达的重组AmPAL经纯化后进行
SDS-PAGE电泳显示1条蛋白条带.酶活性测定表明,携带6个组氨酸的重组蛋白并不影响蛋白质的功能,
可保持PAL原有的生物活性.
关键词:膜荚黄芪;苯丙氨酸解氨酶;表达;纯化
苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase, PAL, EC 4.3.1.5)是连接初级代谢和苯丙烷类代
谢、催化苯丙烷类代谢第一步反应的酶,是苯丙氨酸代谢途径的关键酶、限速酶[1].探讨PAL与黄酮、生物碱
等重要次生代谢产物积累的关系,有目的的通过PAL调控富集次生代谢产物成为当前研究的重要领域[2].
黄芪来源豆科植物膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.) Bge.或蒙古黄芪Astragalus membrana-
ceus(Fisch.) Bge.var.mongholicus(Bge.) Hsiao干燥根,为传统的补气之良药,具有补气固表,利尿排脓,
敛疮生肌的功效,类黄酮是其有效成分之一[1].近些年来研究表明,在黄芪中PAL活性与类黄酮含量变化基
本相符,PAL活性升高,黄酮合成量也增加,即PAL活性增加与类黄酮的富集成显著正相关[3,4].为了进一
步了解膜荚黄芪PAL生物学活性,该研究构建了原核表达载体,在大肠杆菌中对其进行表达和纯化,并得到
具有生物学活性的蛋白质,为深入开展黄芪PAL酶基因作用机制研究奠定基础.
1 材料与方法
1.1 材料
1)质粒和菌种 质粒pT-AmPAL,内含膜荚黄芪PAL(AmPAL)基因cDNA全长;克隆菌株JM109
由本实验室保存.pQE30/M15原核表达载体系统购自QIAGEN公司.
2)引物设计 根据目的AmPAL基因序列,设计1对具备相应多克隆酶切位点的引物为扩增引物
(表1),用以将目的基因片段构建于大肠杆菌(E.coli)表达载体pQE30中.引物由上海生工生物公司合成.
表1 对附带相应的多克隆酶切位点的引物设计
Table1 Designed primers attached mμltiple cloning sites of interested genes
基因引物碱基序列限制性内切酶
PAL上游引物P1
下游引物P2
GGATCC ATGGAGGGAGAAGG
GTCGAC CTAAGAAATTGGAAG
BamHⅠ
SalⅠ
1.2 方法
1)原核表达载体的构建 以质粒pT-AmPAL[1]为模板,反应体系中含有10 ng模板, 2. 5 mmol/ L延 边 大 学 农 学 学 报第32卷
dNTP,上下游引物各为20 p mol, Taq酶1.5 U;PCR反应条件为94℃,30 S,55℃,30 S,72℃,2 min.用
限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ分别酶切PCR产物和载体PQE30的质粒DNA,以T4-DNA连接酶22℃
连接转化到大肠杆菌菌株JM109中,取阳性克隆提取质粒DNA,经限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ酶切鉴
定,获得预计分子量大小的重组质粒,命名为pQE30-AmPAL.
2)AmPAL在大肠杆菌中的诱导表达 取10 ng pQE30-AmPAL质粒,热激转化到原核表达大肠杆
菌菌株M15中,加入1 mmol/L IPTG进行融合蛋白的诱导表达.
3)重组AmPAL蛋白的纯化 离心收集pQE30-AmPAL诱导表达菌,加入30 mL Lysis buffer(50
mM NaH2PO4, 300 mM NaCl,10 mM imidazole, pH值8.0),加溶菌酶使其终浓度为1 mg/mL,裂解细菌,
离心收集上清液.用Ni-NTA琼脂柱纯化目的蛋白质,用3倍体积的Wash Buffer(50 mM NaH2PO4, 300
mM NaCl, 20 mM imidazole, pH值8.0)清洗柱,重复5次,清洗完毕后,加入500μL Elution Buffer(50
mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH值8.0),收集蛋白液.取适量样品,进行10 % SDS
-PAGE电泳检测,采用考马斯亮蓝进行胶染色.
4)重组AmPAL酶活性测定 PAL酶活性测定参照现代植物生理学实验指南[5]的方法.反应体系包
括2 mL 0.1 M/L Tris-HCl(pH值8.8),1 mL 0.02 M/L L-苯丙氨酸,37℃水浴保温5 min后,加10μL
PAL酶,在紫外可见分光光度计上(290 nm处)立即测定起始OD值,空白用10μL水替代,并精确计时.将
第1次测定后的试管放入37℃水浴保温反应30 min后,再测定各管的OD值.将第2次测得的OD值减去
第1次测得的相应管的OD值,可得到该酶在30 min反应的实际活性,再换算成U/(mLh).酶比活性以每
mg蛋白质中酶活力单位数表示,即U/mg.
2 结果与分析
2.1 原核表达载体的构建和转化
以pT-AmPAL质粒为模板,PCR扩增(引物P1和P2),得到2.2 Kb左右的扩增产物,此扩增产物和
pQE-30载体连接转化到大肠杆菌菌株JM109中,用限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ酶切鉴定(图1中的泳
道1),有目的条带pQE30(3.5 Kb)和AmPAL(2.2 Kb),得pQE30-AmPAL质粒.将重组质粒pQE30-
AmPAL热激转化导入表达菌株大肠杆菌M15中,得单克隆菌株.
图1 重组质粒pQE30-AmPAL酶切鉴定
Fig.1 Agarose gel electrophoresis of pQE30-AmPAL digested by restriction enzymes
2.2 重组AmPAL在大肠杆菌M15中的表达和纯化
为表达重组融合蛋白,首先进行小量的IPTG诱导表达.诱导完毕后,取样,进行SDS-PAGE电泳检
测.由电泳图谱可见(图2,M:分子量标记(KDa);泳道1~6:由IPTG诱导0,30,60,90,120,150 min;箭
头:6×His-AmPAL,下同),在经过IPTG诱导转化入pQE30-AmPAL的菌液粗蛋白中,出现1条新的预
期的蛋白条带产生,分子量大小为78 kDa左右,而未经IPTG诱导的菌液粗蛋白中未见此条带.结果表明,
重组质粒pQE30-AmPAL在IPTG诱导下,产生融合蛋白6×His-AmPAL,并得以高效表达;从表达趋
势上看,随着诱导时间的延长,融合蛋白6×His-AmPAL的表达量逐渐增大.
230 第4期吴松权,等:膜荚黄芪苯丙氨酸解氨酶在大肠杆菌中的表达和纯化
图2 融合蛋白6×His-AmPAL诱导表达的SDS-PAGE电泳图 图3 融合蛋白6×His-AmPAL纯化后SDS-PAGE电泳图
Fig.2 SDS-PAGE analysis of expression of6×His-AmPAL Fig.3 DS-PAGE analysis of purification of6×His-AmPAL
为纯化融合蛋白,对融合蛋白进行大量表达,并对融合蛋白的表达条件进行优化与筛选.结果表明,融合
蛋白6×His-AmPAL的适宜诱导温度为28℃,IPTG浓度为0.4 mmol/L,诱导时间为2 h.诱导融合蛋白
6×Hs-AmPAL进行大量表达,使用Ni-NTA Agarose进行一步法纯化,所获蛋白进行SDS-PAGE检
测.结果表明获得了高纯度的重组融合蛋白(图3,泳道2).
2.3 重组AmPAL酶活性测定
试验以每小时在290 nm处0.01 OD变化为1个酶活性单位,通过Bradford法测定酶液的蛋白质含量.
在测定6×His-AmPAL酶活性过程中,通过调整L-苯丙氨酸(L-Phe)及所测酶液的配比使用量,测定
酶最大反应速率,取其倒数采用Lineweaver-Burk双倒数做图法(图4),求出米氏常数Km值为3.35×10-4
mM /L.纯化后蛋白的酶比活性为6 500 U/mg蛋白质,表现出很强的酶比活性,与纯化前粗提取物的活性
相比提高了4.8倍.
图4 6×His-AmPAL底物亲和力的双倒数曲线图
Fig.4 Lineweaver-Burk double reciprocal plots of6×His-AmPAL using L-Phe
3 讨论与结论
pQE表达系统是QIAGEN公司提供的一种操作方便的高效表达和纯化外源蛋白的原核表达系统.
pQE载体含有6×His编码序列,这对重组蛋白的纯化相当重要,它使重组蛋白的N端产生6×His,通过金
属离子的螯合作用,带6×His的重组蛋白就可以连接到Ni-NTA琼脂柱上,经过洗涤和洗脱获得高纯度
的重组蛋白,从而使纯化过程一步完成.而且6×His标签分子量小,不会影响被修饰蛋白质的生理pH值、
231延 边 大 学 农 学 学 报第32卷
免疫原性、结构和功能,也不会干扰蛋白质的分泌,抗His抗体还可被用来检测表达的蛋白.
该试验成功地构建了pQE30-AmPAL重组表达质粒,并使6×His-AmPAL在E.coli M15中得到高
效表达.经过Ni-NTA柱后,重组蛋白的6×His标记与Ni-NTA柱上的Ni2+特异性结合,洗脱后SDS-
PAGE结果显示1条分子量为78 KDa左右的单一条带,与预测的结果一致,说明重组AmPAL蛋白已被高
度纯化,每克细胞(干物重)纯化出45 mg 6×His-AmPAL,足以进行酶学特性方面的研究和以其为抗原制
备目的蛋白的抗体进行免疫学检测、生理生化等研究.对纯化所得融合蛋白的酶活性测定表明,融合蛋白6
×His-AmPAL对L-Phe的米氏常数Km值为3.35×10-4mM/L,与贺立红[6]等各种来源的PAL Km
不同,为10-4~10-2mM/L的报道一致,而且表现出很强的酶比活性,为6 500 U/mg蛋白质,比纯化前的
粗蛋白比较酶活性提高了4.8倍之多.而从转大豆PAL基因的E.coli工程菌株和红酵母纯化出的PAL酶
比活性只有211.7,250 U/mg蛋白质[7].此外,6×His-AmPAL融合蛋白无需变性和复性便可降解L-
Phe,进一步验证了Schuly等[8]和Sarkissian等[9]的报道,即重组表达的PAL能自动形成酶的催化活性中
心,并且在该酶反应系统中无须其它辅因子的参加就能催化苯丙氨酸脱氨生成肉桂酸,这为今后实际应用奠
定了基础.
pH值为10.0时,PAL催化肉桂酸和氨,氨化加成生成L-苯丙氨酸(L-phenylalanine).利用PAL这
种逆向催化特性转化肉桂酸生产L-Phe(酶法生产),已在国内外投入商业规模开发,成为当前生物化工领
域研究与开发的热点.而在此过程中,PAL活力不高且极易失活大大制约L-Phe的高浓度生产,是肉桂酸
转化生产L-Phe的难点.因此,进行PAL产生菌筛选及酶促反应的研究就极富学术意义和应用价值[6,10].
而本研究中通过基因重组技术构建的新的含有表达载体质粒pQE30-AmPAL菌株,具有较高的酶活性,有
可能作为参考菌株来满足生物化工对高性能PAL工业生物催化菌种的需求.
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[下转第253页]
232 第4期朱玉霞,等:温度和乌苯苷对延边黄牛卵母细胞Na/K ATP酶活性的影响
Effect of temperature and ouabain on the activity of Na/K ATPase of
oocyte in Yanbian Yellow Cattle
ZHU Yu-xia1, LI Zhong-shu1, WU Hao2, FANG Nan-zhu1, LI Fu-jun1*
(1.Agricultural College of Yanbian University,Yanji Jilin133002,China;
2.The Management Station of Grassland in Wangqing County,Wangqing Jilin133200,China)
Abstract:Stadied the character of oocytes of Yanbian Yellow Cattle by researching the effect of tempera-
ture on oocytes of Yanbian Yellow Cattle and the max concentration of ouabain, the specific inhibitor of
Na/K ATPase, and the effect of granular cell on the active of Na/K ATPase, which are the great founda-
tion of the further study about the relationship between the active of Na/K ATPase and the vitro mature of
oocytes of Yanbian Yellow Cattle. The results showed that the active of Na/K ATPase reached the max
value at 50℃, and the active degraded below or over 50℃. The partheno oocytes cann’t cleavage com-
pletely in present of ouabain at 2 mmol/L. The active of Na/K ATPase in grade A group, ova nuda group
and hyper-mature group were detected, there were no significant difference among the three groups tested,
but the value of ova nuda group was the highest. The conclusions were that the optimal react temperature
of Na/K ATPase of the oocytes of Yanbian Yellow Cattle was 50℃and the max suppressible concentra-
tion of ouabain was 2 mmol/L. The active of Na/K ATPase in ova nuda group was the highest.
Key words:Yanbian Yellow Cattle;oocytes; Na/K ATPase;temperature;ouabain;granular cell
[上接第232页]
Expression and purification of phenylalanine ammonia lyase of
Astragalus membranaceus in E.coli
WU Song-quan1,2, QUAN Xue-li2, PIAO Xuan-chun1,2, YIN Cheng-ri1
(1.Key Laboratory of Natural Resources of Changbai Mountain & Functional Molecules of Yanbian University;
2. Agricultural College of Yanbian University, Yanji Jilin133002,China)
Abstract:To further understand the function and biological activity of PAL of Astragalus membranaceus
(AmPAL), a procaryotic expression vector pQE30-AmPAL was constructed with the technology of recom-
binant DNA, and recombinantAmPAL was expressed and purified in E.coli M15. The results showed that
successfully constructed procaryotic expression vector pQE30-AmPAL with the digestion of restriction en-
donuclease, the recombinantAmPAL was largely expressed in E. coli M15 and the expression product of
recombinantAmPAL showed a single protein on SDS-PAGE after purification. After determination of PAL
activity, six histidine residues did not interfere with the function of theAmPAL and the recombiant
AmPAL had intrinsic PAL activity.
Key words:Astragalus membaranceus;phenylalanine ammonia-lyase;expression;purification
253
莫荚黄芪苯丙氨酸解氨酶在大肠杆菌中的表达和纯化.doc
