重组奶牛神经肽Y基因的原核表达及生物活性检测
重组奶牛神经肽Y基因的原核表达及生物活性检测
摘要:为了深入了解神经肽Y在奶牛摄食过程中所起到的作用和体内其他生物分子之间的相互作用,本试验利用分子生物学技术,从荷斯坦公
牛犊的下丘脑中克隆得到神经肽Y基因,通过测序表明,与GenBank上所列神经肽Y基因序列完全一致。然后利用原核表达系统,构建原核表达
载体pGEX-3X-NPY。在DE3菌中进行了诱导表达,对表达产物进行检测、条件优化和初步纯化。并经生物学活性检测,重组蛋白对鸡胚血管生
成的刺激作用明显,表明重组神经肽Y具有生物学活性。
关键词:奶牛;神经肽Y;基因;克隆;表达;生物活性
在奶牛的饲养过程中,由于高产品种的引进、培
育,高能饲料的开发、利用,规模化饲养程度的提高
等众多方面的原因,使得酮病和脂肪肝的发病率长期
以来一直居高不下。因此,奶牛酮病、脂肪肝一直被
各国列为最重要的奶牛疾病而加以研究[1-3]。而神经
肽Y (neuropeptideY, NPY)是目前发现的唯一能使
动物摄食过多的神经肽,参与摄食的启动与维持,能
够增进动物的食欲,提高采食量,充分发挥动物的生
产潜力[4]。神经肽Y是由36个氨基酸组成的活性
肽,由于结构中富含酪氨酸,故称为神经肽酪氨
酸[5]。它具有促进动物采食、影响激素分泌、心血
管功能、调节体温、生物规律、性行为等各种生物学
功能,越来越受到人们的重视[6]。近年来,关于
NPY对人和鼠等其他动物血糖的调节方面已有相关
报道,而在奶牛上的研究较少。为深入了解外源性
NPY的结构、功能,本试验采用分子生物学技术,
进行奶牛NPY基因表达纯化,对其重组蛋白NPY的
生物活性进行研究。
1 材料与方法
1·1 材料
1·1·1 菌株与载体
大肠杆菌JM109、BL21 (DE3)菌株为本室保
存, pGEX-3X表达载体为Pharmacia公司产品。
1·1·2 试验动物
1日龄荷斯坦公牛犊1头, 47 kg。
从表4可看出,试验猪到120日龄和150日龄的
口蹄疫抗体水平D组略微好于C组,说明D组口蹄
疫免疫程序较C组合理,在一定程度上说明该场口
蹄疫60日龄首免好于70日龄首免。C、D两组试验
猪60日龄口蹄疫母源抗体合格率均低于50%,该场
仔猪口蹄疫的首免日龄应定在60日龄之前免疫。
通过免疫抗体效价检测可以看出,猪口蹄疫合成
肽疫苗在抗体产生速度、高度、整齐度以及免疫应激
方面好于猪口蹄疫O型206佐剂高效苗。但合成肽
疫苗抗体能否抵抗野毒的侵袭,有待时间的考证。
本次试验中由于采样间隔时间的关系,猪瘟母源
抗体对猪瘟疫苗免疫的短时间影响,在试验数据中不
能显现,并不能说明母源抗体对疫苗免疫没有影响。
在口蹄疫免疫方面,口蹄疫母源抗体(206疫苗免
疫)对合成肽疫苗有无影响,有待进一步试验。
参考文献:
[1] 王学琼,普加权.猪口蹄疫与猪瘟猪肺疫双联苗同步免疫研究
[J].云南农业大学学报, 2008, (1): 84-86.
[2] 张作仁,胡成林,熊金洲,等.优化猪瘟、口蹄疫免疫效果试
验与研究[J].养殖与饲料, 2005, (9): 30-34.
酶与试剂
TrizolReagent购自Invitrogen公司; Pfu DNA Pol-
ymerase购自Promaga公司;蛋白胨、酵母提取物、
焦磷酸二乙酯(DEPC)、反转录酶(AMV)、Oligo
(dT) 18、Ex-tag酶和各种核酸内切酶购自TaKaRa
大连公司;质粒DNA快速小提试剂盒、T4 DNA连接
酶、DNA片段回收试剂购自维特洁生物技术公司。
1·1·4 标准参照物
标准分子量DNA Marker DL-2000 (分子量为
2 000 bp、1 000 bp、750 bp、500 bp、250 bp、100
bp),蛋白质分子量标准(宽)为TaKaRa公司产品。
1·1·5 主要仪器
PCR仪Tpersonal2000型;高速冷冻离心机
MR18·22型、CO2培养箱、GeneQuant核酸浓度测定
仪、电泳仪DY-III型、紫外透射反射分析仪WP型、
超净工作台。
1·2 方法
1·2·1 丘脑组织总RNA的提取
将犊牛麻醉后,静脉放血处死。采取犊牛下丘脑
组织用于NPY的克隆(RNA的提取和反转录参见
《分子克隆技术》)。
1·2·2 NPY基因克隆
根据GenBank中NPY序列(GI: 154223706)设
计上下游引物:
NPY上游引物为P1: 5′-cgGGATCCaatacccctc-
caagcctg-3′,
NPY下游引物为P2: 5′-gGAATTCtcagtatctctgcctg-
gtgat-3′。
其中大写字母为引入的酶切位点BamHⅠ和
EcoRⅠ。
反应体系及扩增条件为: 94℃预变性5 min;
94℃变性45 s, 57℃退火45 s, 72℃延伸45 s, 30
个循环;最后72℃延伸10 min。
将回收到的PCR产物与pMD18-T载体连接,构
建克隆质粒pMD-NPY。
1·2·3 NPY基因序列测定
将克隆质粒pMD-NPY送到测序公司进行测序。
1·2·4 原核表达载体的构建及鉴定
利用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ对克隆质
粒pMD-NPY和表达载体质粒pGEX-3X进行双酶切,
得到目的基因和大片段。通过T4 DNA连接酶连接,
并挑选阳性重组子提取质粒,采用PCR及双酶切
(BamHⅠ/EcoRⅠ)的方法对重组质粒进行鉴定。
1·2·5 重组蛋白在大肠杆菌细胞中的诱导表达
鉴定正确的表达质粒转化入BL21感受态细胞,
进行诱导表达,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-
PAGE)检测。并取出1 mL菌液留作对照(0 h),
加IPTG至终浓度为1mmol/L,继续诱导培养,于2、
3、4、5 h后收集菌液1 mL,对表达条件进行优化。
1·2·6 融合蛋白的亲和纯化及目的蛋白含量测定
利用GST-Resin柱进行融合蛋白的纯化,并利用
华特生ProteinAssay试剂盒测对纯化的目的蛋白含量
进行测定。
1·2·7 重组蛋白生物学活性检测
选取9日龄SPF鸡胚20只,分为对照组、NPY
蛋白组,每组10只,将滤菌后的重组蛋白(20μg/
鸡胚)用微量注射器滴加在实验组的鸡胚尿囊绒膜
上,对照组滴加等量PBS,封口后继续孵化。72 h
后,观察鸡尿囊绒膜的血管生成反应。
2 结果
2·1 丘脑组织总RNA的提取
电泳中,分别出现18S、28S和5·8S三条电泳带
(图1),说明RNA没有降解,提取的RNA完整。
1.样本1总RNA; 2.样本2总RNA
图1 丘脑组织RNA在1%琼脂糖凝胶上的电泳
2·2 NPY基因的克隆
以犊牛丘脑cDNA为模板,应用引物P1和P2,
进行PCR扩增,得到1条与预计大小相符的DNA片
断(图2),测序结果显示克隆正确,融合基因的序
列与试验设计完全一致。
2·3 NPY基因序列测定
与GenBank中所列基因(GI: 154223706)相比
较,基因符合率为100%,表明克隆基因为所需要的
目的基因。
2·4 原核表达载体的构建及鉴定
鉴定正确的质粒pMD18-T-NPY,经BamHⅠ和
EcoRⅠ双酶切、连接至pGEX-3X载体,重组质粒经
PCR,BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切筛选鉴定连入NPY阳
性克隆(图3)。获得重组表达载体命名为pGEX-
3X-NPY。
·72·AnimalHusbandry& VeterinaryMedicine 2010 Vol·42 No·92·5 融合蛋白表达
pGEX-3X-NPY (DE3)的诱导产物经SDS-PAGE
分析表明,在相对分子量约为30·0 ku的重组蛋白
NPY得以表达(图4)。
M.标准蛋白分子量; 1. pGEX-3X-NPY (DE3)诱导;
2. pGEX-3X-NPY (DE3)未诱导
图4 pGEX-3X-NPY诱导结果
通过对pGEX-3X-NPY (DE3)在不同的浓度
IPTG和不同诱导时间的诱导产物SDS-PAGE分析,
最佳诱导IPTG浓度为1·0 mmol/L,诱导时间为3 h
(图5)。
M.标准蛋白分子量; 1-4. IPTG浓度为1·0, 4·0, 8·0, 10·0
mmol/L pGEX-3X-NPY (DE3)梯度诱导; 5-8.诱导时间为2、3、4、
5 h, IPTG浓度为1·0 mmol/L
图5 pGEX-3X-NPY (DE3)不同诱导
条件下的NPY产量
2·6 融合蛋白的亲和纯化、蛋白含量测定结果
通过亲和纯化可有效得到目的蛋白,且基本无杂
带。将过柱纯化得到的特异目的蛋白,利用华特生
Protein Assay试剂盒测定目的蛋白的浓度为1·5
mg/mL。
2·7 重组蛋白生物学活性检测
使用原核表达的重组蛋白处理鸡胚尿囊绒膜后
72 h,观察鸡尿囊绒膜的血管生成反应,结果发现与
使用PBS的对照组相比,重组NPY蛋白对鸡尿囊绒
膜的血管生成有促进作用,可使血管的分支增加,管
径变粗,而对照组PBS不明显。见图6。
A. PBS对照组; B. NPY组
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