Fe,Mn,Zn对湖泊藻华爆发影响规律研究
Fe,Mn,Zn对湖泊藻华爆发影响规律研究#
陈仕光1，王志红2，曹欣2
( 1.仲恺农业工程学院城市建设学院，广东 广州 510225；2.广东工业大学土木与交通工程学院，广东 广州 510006 )
[摘 要] 水中微量金属元素对淡水浮游生物量有不可忽略的影响作用。通过设计正交组合实验，研究3种典型金属元素Fe,Mn,Zn，结合代表性常量元素磷，考查对淡水藻类生长的影响。结果表明：当P浓度介于0.04~0.32mg/L之间时，藻生物产量随着P的增加而增加；当Fe浓度低于0.05mg/L时，表现为促进藻类生长；高于0.1 mg/L时，反而抑制藻类生长。Zn的情况类似：在浓度低于0.01 mg/L时表现为促进藻类生长，高于0.04 mg/L时抑制藻类生长。Mn本身没有表现出规律性影响趋势，但与微量元素之间的竞争性抑制有密切关系。实验发现，藻生长速率分别在P(0.16mg/L),Fe(0.05mg/L),Mn(0.05mg/L),Zn(0.01mg/L)时最大，藻生物产量分别在P(0.32mg/L),Fe(0.1mg/L),Mn(0.05mg/L),Zn(0.01mg/L)时最高,说明产生藻生物量最大值和生长速率最大值的环境营养条件不同。四种物质对藻生长速率影响的显著顺序依次为：锌>磷>铁>锰。
[关键词] 金属元素；藻华；生物量；影响规律
Study of effects of Fe, Mn and Zn on the eruption of algae blooming in lakes
Chen Shi-guang1*, Wang Zhi-hong2, Cao Xin2
(1.College of Urban Construction,ZhongKai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510225;2.Faculty of Civil and Transportation Engineering, Guangdong University of Technology， Guangzhou 510006，China)
Abstract: Trace metal elements in waterbodies exert significant impacts on fresh water plankton biomass. Orthogonal experiments were designed to measure the effects of three typical trace elements (iron, manganese and zinc) as well as representative normal nutrition (phosphorous) on algae growth. The results obtained appear to show that algae biomass increased with the increase of the concentration of P between 0.04mg/L and 0.32mg/L. Algae growth rate was promoted at the concentration below Fe(0.05mg/L), while was inhibited at the concentration above 0.1 mg/L. As to Zn there was a similar situation. It showed a promotive effect on algae growth rate below 0.01mg/L and an inhibitive effect above 0.04 mg/L. However, manganese(Mn) showed no regularity influence on algae, which should be ascribe to the competitive inhibitory effects among multi-microelements. It was also found that algae growth rate reached the maximum value at the concentrations of P(0.16 mg/L), Fe(0.05 mg/L), Mn (0.05 mg/L) and Zn(0.01 mg/L) while algae biomass of P(0.32 mg/L), Fe(0.1 mg/L), Mn (0.05 mg/L) and Zn(0.01 mg/L). It can be concluded that the environmental nutrient conditions of the algal biomass maximum and the maximum growth rate are different. The results show that the significant level of the four kinds of substances on algae growth rate is in the order: Zn>P>Fe>Mn.
Key words: metal elements; algae bloom; biomass; the influence regulation
藻华(赤潮)是由水体环境改变，引起浮游藻类爆发性增殖的一种生态异常现象。藻华不仅破坏水体正常生态系统，而且会产生藻毒素，危害人类健康。因此，深入研究引起藻华的原因，寻找藻类暴发性增殖的规律成为藻华研究的重要方向。
综观国内外的研究现状，绝大多数致力于影响藻华的环境因素和营养因素方面，其中又以对氮、磷营养限制的研究最为普遍。直到上世纪80年代，研究发现，许多高营养低叶绿素(HNLC)的水体，浮游生物产量与铁(Fe)相关后，微量金属元素对藻类生长的影响成为该领域的研究热点和重点[1-6]。最近20年来，人们通过大量的烧杯实验或实地营养加富实验，对微量元素的影响行为进行了广泛的探究。但是，以往的研究大多专注于单一元素的驱动效应，即从一种元素的浓度变化入手，建立该元素与藻类生物量的关系模型[7-10]。研究的结论可以解释在纯实验条件下的藻增殖现象，但在实际藻华预测中，这些模型往往表现出很大的局限性。这和藻类营养因素的多样性及交互性有很大关系。因此，进行多种营养元素影响程度的比较，微量营养与常量营养的比较，分析二者的联系与差异，有助于解决目前单因素评价模型存在的各种不确定性问题。
本研究选取水体中常见的代表性微量金属元素Fe,Mn,Zn, 结合代表性常量元素无机磷(P)，以天然原水中常见的绿藻、蓝藻为实验研究对象，通过模拟实验，研究水体富氮饱和条件下，P与Fe,Mn,Zn的浓度变化对浮游藻类生长的影响规律。
1 材料与方法
1.1试验材料
本研究选择的藻种为不分种群的自然藻群体，取自广州大学城某一湖水(湖心位于N23°02′,E113°23′)。该湖夏季水温25~32℃，冬季水温在15~20℃左右，湖水平均浊度1~3NTU，总氮平均0.6mg/L，总磷平均0.03mg/L，氮磷质量比均值20:1，属中度富营养水源。原水藻类密度在0.2~6×104个/L之间，主要生物种类为绿藻和蓝藻，实验阶段内藻种分布情况及比例比较稳定，具体见表1。培养液采用朱氏改良10号[11]。本实验所有使用试剂均为分析纯。
[基金项目] 广东省科技攻关资助项目（2007B031700007）；广东省自然科学基金(9151009001000048)
表1 原水藻类种群分布情况
Table 1 Composition of algae organisms in origin water
1.2 实验方法
为了除去原水自带元素的干扰，试验前，先对原水藻种扩大培养1周，取一定体积的含藻原水以5000r/min的速度离心15min，弃掉上清液， 用15mg/L的NaHCO3溶液洗涤后离心，重复3次，用无菌水稀释后接种于不含P,Fe,Mn,Zn的培养基中进行饥饿培养，2d以后加入P,Fe,Mn,Zn元素，开始实验周期，实验初始藻密度为1.3×104~3.4×104个/L左右。
采用L16(45)正交表安排实验顺序，确定的因素为：P(Na3PO4.12H2O),Fe(FeCL3),Mn(MnSO4H2O),Zn(ZnSO4.7H2O)，以各种物质在自然水体中的常规浓度范围设计因素水平，为初步考虑突发性金属超量的影响，最后一个水平均设计为高浓度水平，具体如表2所示。培养容器采用自行设计的微循环藻类培养箱，以白炽灯为光源，光强控制在4000~5000Lux，光照时间比为14:10，每日定时搅拌3~4次，以促进营养物质循环，减少器壁效应。实验温度为室温环境，实验时间为2009年3月~9月，每日水温有1.5~2.5℃的变化幅度，整个实验期间水温变化范围为25.6~31.5℃。
表2 因素水平表
Tab.2 factors and levels of orthogonal test
1.3测试方法
实验期间，每天对培养液中金属离子浓度进行检测。Fe3+采用邻菲罗琳分光光度法；Mn2+采用高碘酸钾氧化分光光度法；Zn2+采用双硫腙分光光度法。
藻细胞计数：每天8:30定时取样，取样前先将培养箱水体混合均匀，准确吸取100mL样品加入适量的福尔马林固定藻细胞，然后用移液器吸取lmL含藻细胞的液体置于0.1mL浮游生物计数框，在10×40倍显微镜下，计数二片取其平均值[11]，绘制生长曲线，并计算藻峰值(个/L)及生长速率μ(d-1)。其中藻生长速率μ(d-1)的计算方法为：
(1)
式中：X1为t1时的细胞数(个/L)； X2为t2时的细胞数(个/L)；t为培养时间(d)。
生物量统计为藻类总数，用细胞密度值来表征生物量。使用仪器为重庆奥特光学仪器有限公司的BK系列生物显微镜；上海华岩仪器设备有限公司生产的HL-JS藻类计数框。
2 结果与分析
铁、锰、锌三种元素因具有分布的广泛性和高度可生物利用性等特点，故用来作为浮游生物微量元素影响因子中的代表进行研究，选择磷作为实验因素，是为了比较金属离子与常规营养的影响差异。实验结果见表3。
为进一步考查对藻生长速率的影响，通过计算得到表3最后一列。表3中的生长速率μ是指培养周期内藻类平均生长速率，按公式(1)计算。
各元素水平的影响速率以每个因素的同一水平所在培养周期的生长速率均值表示，结果见表4。
表3 正交实验结果及直观分析表
Tab.3 Results of orthogonal test and direct analysis
表4 各因素各水平的平均生长速率
Tab. 4 Mean growth rate of each factor level
1/4, 2/4, 3/4, 4/4分别表示各种元素在第1，2，3，4水平下的平均生长速率
2.1 微量营养对藻生长速率与生物量影响
2.1.1 P的影响分析
由图1可知，在递增的4个磷浓度水平内，藻生物量呈明显的上升趋势，拟合回归方程表明在实验浓度范围0.04~0.32mg/ L之间，磷与藻类生物量呈一次线性相关。这说明从常量元素氮、磷的角度看，当氮饱和时，磷的含量与藻华爆发的生物量高峰值之间有很好的相关性，对藻类生物量的影响是显著的。通过对水体中总磷含量的监测，可以对藻华爆发潜力进行一定精度的预测。
另一方面，从表4中可以发现，在P含量为0.16mg/L时,藻细胞生长速率是最高的，为0.431，说明藻生长速率与磷浓度并非正相关，存在一个使藻类生长速率最高的最佳浓度，本实验中为0.16mg/L。考虑到实验采用的是正交实验，P的水平非连续，可以进一步认为，该最佳浓度与原水水质有着密切关系。认为可以作如下解释：生长速率的大小一定程度上可以反应藻类的生物活性，即细胞活性越强，生长越快，对磷的吸收代谢也就越旺盛，促进藻的生长。当外界磷浓度趋近于藻类的最佳需求浓度时，一方面促进藻类的大量繁殖，另一方面，旺盛的生长迅速消耗了体系中的磷，造成缺磷的环境，限制了藻生物量的进一步增加，使得生长速率反而减慢。从藻华预测的角度来说，生长速率意味着藻华高峰值来临的时间问题。生长速率越快，高峰值到来的时间越早。这说明藻华的预测问题应该从高峰值(生长潜力)和爆发时间预测两方面来解决。
2.1.2 铁的影响分析
从图2可看出，当培养液中的初始铁浓度从0.01mg/L增加到0.1mg/L的过程中，藻生物量呈依次增加的趋势，表明藻类的生物量与环境铁浓度在0.01~0.1mg/L范围内是呈正相关的，但是，过高的铁浓度反而会使藻生长受到抑制，如图2所示，当铁含量为1.0mg/L时藻生物量明显低于0.1mg/L条件的生物量，而根据表4的结果，铁在0.05mg/L时，藻生长速率已经达到最大值。
分析认为：藻类在某种铁浓度下表现出最大生长速率时，水体中可利用的铁会被快速增长的藻类所消耗掉而限制藻类的进一步增长，具体表现为藻生物量高峰期会相对提早到来，但高峰值不一定最大。但如果水体有外界营养的补充得以维持与生长速率相一致的铁浓度水平，就可能同时发展为藻生物量高峰值达到最大值。因此根据水体营养状态预测藻类生物量时，既要分析各种元素的现有含量，又要对其可能的来源、赋存状态、迁移转化规律等进行深入研究。
根据本次实验的结果，当环境铁浓度处于0.05~0.1mg/L范围时，藻类生长速率与生物量将达到最高值水平，铁的这一浓度范围值可作为估测藻类生长潜力(最终生物量)的重要参考。
2.1.3 锌的影响分析
根据图3得知，在4种不同锌浓度条件下，以锌含量为0.01mg/L时的藻生物量最多，其次是0.001mg/L锌环境下，说明藻类对锌需求的合适浓度范围处于0.01mg/L以内。当锌为0.01mg/L时，藻生物量高达94.8×104个/L，比0.001mg/L浓度条件下增加了约16%，表明增加锌含量对藻类的生长起到了一定程度的促进作用，而在0.01mg/L锌条件下，藻类生长速率达到了0.468，为本次实验各因素水平的最高值(如表4)，这表明，当环境中锌含量接近于0.01mg/L时，藻类极有可能受锌的刺激而发生爆发性增加的现象。
但是，当锌浓度提高至0.04mg/L时，藻类增殖受到了明显抑制作用，由图3可见，0.04mg/L条件下的藻生物量比0.01mg/L和0.001mg/L两种环境下的藻生物量都要低，而当Zn含量达到0.16mg/L时，生物量仅有16.9×104个/L，只有0.04mg/L条件下的27%，表明Zn一旦过量，会对藻类产生非常强烈的毒害作用。根据表4，藻生长速率与生物量的变化趋势相同。锌对藻类的影响表现为需求低，高敏感。
2.1.4 锰的影响分析
锰对藻类生物量的影响如图4所示，在0.05mg/LMn浓度条件下，藻生物数量较0.01mg/L锰条件时有所增加，当Mn浓度为0.1mg/L时生物量出现下降，而当锰高至1.0mg/L时藻生物量较0.1mg/L条件下又有明显增加，根据表4结果，藻平均生长速率在0.05mg/L锰条件时达到最大值，生长速率的变化趋势与生物量变化趋势基本一致。
以往普遍认为，任何营养元素只在某一确定浓度处对藻类有最大促进效果[13]，也就是说，营养物质对藻生物量的影响曲线应为单峰曲线。从图4来看，生长速率和生物量在4级Mn浓度水平内呈增加-下降-增加的趋势。导致这种情况的出现，分析认为可能与藻类培养体系中Mn2+的存在状态不稳定有关，即Mn2+发生了价态改变，或与其他离子发生吸附络合，导致可生物利用的有效Mn2+浓度与初始加入的锰不一致(见图5)，也就是说，培养液中,初始锰浓度的变化由于水中存在形态的变化，并没有完全的体现出来。
除此之外，我们还认为，金属离子之间的相互作用也会对锰的生物可利用程度产生一定的影响，如图5所示，培养周期中，溶解态的P,Fe3+,Zn2+变化趋势基本一致，而Mn2+在其它3种离子大幅下降时，浓度反而升高。表明藻类在强烈吸收P, Fe或Zn时，并未同步吸收Mn，而锰的增加可能是吸附态的锰发生解吸作用所致。同时，有研究表明，藻细胞对锰吸收的量与藻生长体系的铜、锌浓度成反比【14】。这意味着一种元素的存在会抑制藻类对另一种元素的吸收。本实验中，藻对锰的吸收被锌抑制。综合这两方面的因素，锰本身对藻类的影响规律不确定，需要深入考察锰在水中的存在形态和共存金属元素的影响。
这说明，仅仅根据单一元素的变化来评价藻类生长潜力会面临一定的不确定性因素，因此，扩大试验对象范围，深入研究多种影响因素的交互作用、协同机理对于完善藻华预警体系具有重要意义。
2.2 四因素方差分析
对四种物质磷、铁、锰、锌的影响程度作方差分析，得到结果如表5所示。
表5 方差分析
Table5 Analysis of variance
从表5来看，4种物质均没有达到显著性要求(F＜F0.05)。这与观察变量的性质和检验标准的选取有关，即不同的实验对象所适用的标准不一样，需要依靠经验来判断[15]，关于藻类影响因素的显著性检验标准仍有待确定。然而，从各种因素离差平方和的比较来看，磷、铁、锌均产生了超过误差离差值(0.0199)多倍的离差平方和，故依然可以将磷、铁与锌看作是对藻类生长速率有显著影响的因素，只有锰的离差平方和(0.0177)与误差离差值相当，说明本次试验中，锰对藻生长速率影响很微弱。依据表5的结果，四种物质的显著性顺序依次是：Zn>P>Fe>Mn.
2.3金属元素对藻类作用机理分析
按照元素在生物生理方面的功能和需要，可将组成生物体的元素划分为必需元素和非必需元素。如果某种元素被证明是藻类所必需的，则该元素称为必需元素。环境中必需元素与非必需元素的含量(或浓度)同生物生长的关系有着不同的规律，如图6所示[16]。因此，可以根据元素浓度和藻生长之间的规律判断是否为必需元素。
从实验结果和2.1中的分析显示，Fe, Mn, Zn对藻类产量的影响规律表现为明显的图6(a)——必需元素规律：
1）当P低于0.16mg/L，Fe低于0.05mg/L，Mn低于0.05mg/L，Zn低于0.01mg/L时，藻类由于缺乏这几种元素而不能完成其生命循环，处于“饥饿”状态。此时如果补充一定量的这些营养物质，会大大促进藻类的增殖，如图2~4中所表示的，藻类生物产量随着元素浓度的上升而呈线性增加，即处于图6(a)中的缺乏状态；
2）当Fe, Mn, Zn分别处于0.05~1.0mg/L, 0.05~0.1mg/L, 0.01~0.04mg/L范围时，基本满足藻类生长的需要，此时，藻生物量保持相对稳定状态，即处于图6(a)中的适合状态；
3）当Fe, Mn, Zn浓度分别高于0.1mg/L, 0.1mg/L, 0.04mg/L时，藻类的生长会受到金属元素过量所产生的抑制作用，处于图6(a)中的中毒状态。
进一步讨论Fe, Mn, Zn的影响：
从前述分析可知，Fe, Mn, Zn都是藻类必需元素。但微量元素过量会对藻类生长产生抑制作用。可以试图作如下解释：
1）从生物的角度，藻类对大部分金属元素的利用首先是金属离子在藻细胞表面的被动吸附，随后吸附的金属离子主动转移至藻细胞内[17]。由于藻细胞对金属离子缺乏主动选择性，使得外部的金属离子源源不断地进入藻细胞内，超过了藻类的代谢能力，过量的金属离子与带负电荷的藻细胞壁发生电荷吸引，以及与一些含S,N,O的官能团发生鳌和反应，造成对藻细胞的毒害作用[18]。表现症状为细胞生长率下降，细胞结构变形、叶绿体和线粒体产生质变。过程如图7所示。
2）产生抑制还与金属离子对酶活性改变有关系。以锰为例：适量的锰可使叶绿素抗氧化酶保持足够的活性，但锰的含量超过一定水平后，叶绿素降解酶的活性就会超过抗氧化酶的活性，原有的平衡被打破，造成叶绿素含量下降[4,10]。这种适量促进，不足或过量抑制的特性，使得很难用线性函数来描述金属元素对藻生物量的影响行为。
3 结论
从上述阐述中，得到如下结论：
在P为0.04~0.32mg/L范围内，藻生物量与P浓度之间呈良好的线性正相关关系。
在试验范围内，P为0.16mg/L 时，藻生长速率为最大值，说明藻生长速率与P浓度之间不是正相关，存在一个最佳的P浓度值，考察不同水体条件下的最佳值对于藻华爆发时间的预测有着重要的意义。
3）在0.05mg/L的初始铁条件下藻生长速率最快，在不高于0.1mg/L的范围内，Fe浓度与藻类生物量持续呈正相关；考虑不同铁浓度对藻华爆发时间(生长速率)与生物量峰值(生长潜力)影响的区别对于藻华的预测具有实际意义。
4）Zn在不高于0.01mg/L的范围内时，与藻类生长速率和生物量呈正相关，对藻生长的影响特点为需求量少，敏感度高。
5）Mn浓度为0.05mg/L时藻类生长速率和生物量水平最高，在藻类培养周期中，Mn2+不如Fe3+和Zn2+稳定，导致锰对藻类作用的规律性趋势不明显。金属离子的稳定性以及多种金属的交互作用也是藻华预测中应着重考虑的因素。
6）四种物质对藻类生长速率影响显著性顺序为：Zn>P>Fe>Mn.
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[作者简介]：陈仕光（1982 — ），硕士研究生，电话:13434252304， E-mail:luyi813929@163.com.通讯地址：广州番禺小谷围大学城外环西路100号广东工业大学西区十栋 510006
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