磁分离酶联免疫技术检测FSH、LH和hCG
【关键词】 磁分离酶 FSH LH hCG
磁分离酶联免疫技术是80年代中期瑞士Serono(史朗洛)诊断中心发明的一种非同位素免疫检测的先进技术，称为磁性抗体免疫技术(MAIA)。使双抗体夹心酶联免疫技术在游离型标记抗体和标记抗原-抗体复合物分离中具有分离完全和快速的优点，也为磁性分离技术的推广创造了条件。我们采用该中心发明的SEROZYME酶联免疫双抗体夹心检测系统(由酶联免疫内分泌定量测定仪和配套试剂盒组成一个完整的检测系统)，分析测定FSH、LH和hCG，将检测的结果报告如下。
1 实验原理
待测物(FSH、LH和hCG)分别用碱性磷酸酶(ALP)和异硫氰酸荧光素(FITC)标记的单克隆抗体反应形成酶标抗体．抗原-FITC标记抗体的复合物，即双抗体夹心，再加磁性分离剂(含有与抗FITC结合的磁性微粒)使复合物与磁性微粒结合，在永久磁体吸引下使其沉淀至管底，分离酶标抗体，加入底物单磷酸酚酞(PMP)，ALP催化PMP水解释放出酚酞，在pH为10．5的缓冲液中呈桃红色，再以永久磁体吸引磁性复合物使其沉淀，上清液置SEROZYME-I型酶联免疫内分泌定量测定仪测定。
2 材料与方法
2.1仪器
SEROZYME-I型酶联免疫内分泌定量测定仪(三波长492 nm、550 nm、630 nm同时检测，程序编辑，曲线绘制，微机控制，打印输出)，磁性分离器和混匀器(由北京倍爱康生物技术有限公司提供)。
2.2试剂
FSH、LH和hCG SEROZYME试剂盒。内容包括：FITC和牛ALP标记鼠抗人hCG、FSH和LH单克隆抗体，FSH、LH和hCG系列标准液，磁分离试剂，清洗浓缩液，基质液，稀释缓冲液和终止液。
2.3检测标本
临床病人，空腹采血。
2.4检测方法
按试剂盒说明书进行操作。先绘制标准曲线，复管测定，用SEROZYME-I型酶联免疫定量测定仪对FSH、LH和hCG进行定量程序测定，自动绘制标准曲线，并将数据贮存入相应的定量程序中。然后以同样方法检测待测标本，各管用仪器直接测定读数。
分为4个步骤：
(1)抗原抗体反应：加入待测血清及反应试剂37℃水浴保温15分钟，使其形成抗原抗体复合物。
(2)磁性分离：加入磁分离试剂，使磁性颗粒与抗原抗体复合物结合，在磁场的作用下沉淀复合物，洗涤，沉淀弃去未反应的试剂。
(3)显色反应：加入基质单磷酸酚酞，使结合在免疫复合物上的酶遇到相应的底物时，发生催化反应，产生有色物质酚酞，加入终止液，该液显桃红色。颜色反应的深浅与相应的抗体或抗原量成正比。因此，可以借助于颜色反应的深浅来定量测定抗体或抗原的量。
(4)读出结果：将已显色的标准管和测定管严格按操作程序在SEROZYME-I型酶联免疫定量测定仪上直接读取结果，每秒测一管。
3 结果
3.1标准曲线(线性范围)
各标准液浓度相对应的吸光度在仪器经对数处理后，线性良好。hCG浓度在0～500 mIU/mL，FSH在0～150mIU/mL，LH在0～200 mIU/mL范围内与吸光度成线性关系。
3.2显色稳定性试验
空白对照(底物液+终止液)和测定管(酶标抗体+底物+终止液)在加终止液后，在不同时间内(1分钟，5分钟，10分钟，20分钟，30分钟，1小时，2小时，4小时，6小时，和24小时)观察其吸光度(550hm)变化。
4 讨论
在双抗体夹心酶联免疫测定法(MAIA)中，分离游离型标记抗体和标记抗体-抗原复合物是一重要环节。分离方法有多种，其中磁性分离技术具有分离完全而快速的优点，但因磁性抗体免疫试剂制备困难而限制了该技术的推广。瑞士Serono诊断中心发明这种磁性抗体免疫技术，称MAIA，为酶联免疫分析中磁性分离技术的推广和应用创造了条件。Serono磁性分离试剂用抗荧光素标抗体与直径1μm的粒子结合成为磁性微粒抗荧光素抗体，它是一种非同位素免疫检测系统。由于抗原抗体反应在液相中进行，不仅反应速度快，而且均匀，时间明显短于固相分离。
我们对该方法在线性范围、显色稳定性、精密度和精确度等方面进行评价。结果显示：标准曲线范围较宽，重复性良好；仪器能储存前次测定的标准曲线数据，不需要每次作标准曲线，可以进行急诊标本的检测，整个检测过程仅需1～2小时。我们在1天24小时不同时间内观察空白管和测定管的吸光度变化，结果为空白管吸光度的变异系数为0．023，测定管吸光度的变异系数为0．004。表明该方法以碱性磷酸酶作为标记物，单磷酸酚酞作为基质，酚酞呈色稳定，重复性较好。将三份不同浓度的标本作连续检测，观察其精密度，批内变异(n=10)：LH平均为2．26％，FSH为2．29％，hCG为2．85％；批间变异(n=5)：IM平均为6．6％，FSH为2．59％。同时，我们分别将不同浓度的LH和FSH加到标本中，作回收试验检测其精确性。结果：LH平均回收率为104．5％，FSH为93．5％。表明该方法具有较高的精密度和精确度，能满足临床测定的要求。
FSH、LH和hCG的磁性抗体免疫检测方法简单，包括孵育、分离、显色和测定四步连续进行，标准曲线绘制及计算结果自动程序化，检测速度快，每秒一管，显著地堤高了工作效率，满足医生和病人即刻测出结果的要求。仪器采用三波长同时检测，可消除试管因素的误差，也增大仪器量程5倍，达10个吸光度，溶液显色稳定。该项技术采用了非同位素的碱性磷酸酶作标记物，免除了对人体和环境有害的放射性物质污染。各项性能指标可与同位素标记的RIA相媲美。采用磁性抗体免疫试剂，开创了磁分离酶联免疫的实用技术，这将是一项很有广阔发展前途的检测方法。
参 考 文 献
[1]陶义训．斑点免疫渗滤试验及其在快速诊断中的应用．全国临床免疫学检验质量保证(第三册)，卫生部临床检验中心，1991，28～30.
[2]李振甲．激素的放射免疫分析．北京：科学技术文献出版社，1985．588～592.
