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纳米抗体：高通量筛选及病毒检测新技术，博士学位论文，共72页，附答辩文稿等。
摘要：
纳米抗体，也称为单域抗体，是一种分子量仅约为 15kD 的基因工程抗体，源于骆驼等动物特有的重链抗体的重链可变区。纳米抗体具有以下主要特征：①分子小；②仅仅重链可变区就可发挥结合抗原的功能；③稳定性好；④可溶性好；⑤易于基因工程操作等。我们利用不同抗原免疫羊驼，构建了多种纳米抗体库，并建立了筛选纳米抗体的新技术。
筛选纳米抗体的常规方法是噬菌体展示技术，该方法非常有效，但仍然有其不足之处，主要包括筛选过程耗时较长、需要纯化大量蛋白进行分析，且只能获得抗体特异性的单一信息。为了提高筛选效率，并在获得特异性抗体的同时，评价抗体的表达量、稳定性和亲和力，我们建立了一种高通量、快速筛选纳米抗体的新方法（FAst Screening of Expression, Biophysical properties and Affinities，简称为FASEBA）。在这个新的筛选系统中，我们将抗BSA 的纳米抗体BSA12 作为标签引入抗体库中，使库中每一个候选蛋白都具有结合BSA 的特性。这就使得对纳米抗体的筛选可以从三方面进行：①筛选不同纳米抗体的表达水平：以BSA为包被抗原，通过ELISA 评价不同纳米抗体的表达水平及可溶性；②筛选不同纳米抗体的热稳定性：通过对含有纳米抗体的细胞培养上清进行加热处理后，再进行以BSA 为包被抗原的ELISA，可以判断不同候选蛋白的热稳定性；③无需进行蛋白纯化即可通过优化的表面等离子共振技术（SPR）高通量得分析不同候选蛋白对靶抗原的亲和力：首先将BSA 化学偶联在芯片表面用以捕获流过的含有BSA12 标签的候选蛋白，之后流过靶抗原来分析其与候选蛋白的亲和力。由
于SPR 芯片表面结合的BSA 非常稳定，因此可以通过再生后重复使用，此过程可以自动循环进行，从而实现大规模高通量的筛选。
为了提高纳米抗体的亲和力，我们将获得的一株流感病毒特异的纳米抗体VHH3B 与志贺氏毒素B 亚基融合，由于志贺氏毒素B 亚基可以自发形成稳定的五聚体，从而可以使纳米抗体VHH3B 五聚化，形成五聚抗体pVHH3B，引入志贺氏毒素B 亚基不仅没有减弱纳米抗体的抗原识别特异性，同时还有效得提高了其亲和力，使之成为一种比较理想的抗体检测试剂，用于流感病毒的检测。
我们基于双抗夹心方法，利用五聚抗体对靶抗原的高亲和性和磁性纳米颗粒具有捕获和分离功能的特性，建立了一种新的生物传感器检测方法用以检测流感病毒。首先，分别将磁性纳米颗粒（MNPs）和金纳米颗粒（GNPs）偶联以五聚抗体pVHH3B 和一株流感病毒特异的鼠源单克隆抗体mAb 3C8。五聚抗体偶联纳米抗体：高通量筛选及病毒检测新技术的磁性纳米颗粒从反应体系中富集流感病毒后，加入的mAb 3C8 偶联的金纳米颗粒通过结合流感病毒而与磁性纳米颗粒形成复合体。利用磁铁将此复合物分离后，其中的金颗粒可以催化对苯二酚的氧化反应，不断生成苯醌，苯醌在390nm处有强的光吸收。通过比较有无流感病毒两个实验组最终生成的苯醌的光吸收值，达到检测流感病毒的目的。此新建立的基于五聚抗体的生物传感器方法对流感病毒的最低检出值为10 ng/ml。这与传统的双抗夹心ELISA 系统相比较，检测灵敏度得到了显著的提升。此种方法在传染性疾病的检测和预防方面有很好的应用价值。
关键词：纳米抗体，流感病毒，五聚抗体，生物传感器，FASEBA

目 录
摘要 I
AbstractIII
目录 V
文献综述2
第一部分纳米抗体研究进展2
1．重链抗体的发现及其特点2
2．纳米抗体的特点、功能及潜在应用价值3
3．纳米抗体用于疾病治疗的探索6
4. 问题与展望7
第二部分噬菌体展示技术8
1．噬菌体展示技术的原理及种类8
2．噬菌体抗体库的构建与抗体筛选9
3．噬菌体展示系统及其它展示技术的发展10
4．问题与展望12
第三部分流感病毒检测、预防和治疗13
1．流感病毒的病毒学特征13
2．流感病毒感染及分子进化机制13
3．检测流感病毒的技术发展15
4．流感病毒的治疗和预防16
5．问题和展望18
研究工作19
第一部分基于五聚抗体和磁性纳米颗粒的流感病毒检测新方法19
1．实验材料20
2．实验方法20
3．实验结果27
4．实验讨论37
第二部分快速高通量纳米抗体筛选方法38
1．实验材料39
2．实验方法40
3．实验结果44
4．实验讨论56
参考文献57
在读期间已发表和待发表文章66
致谢67