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糖抗原sTn及其抗体3P9在肿瘤诊断和靶向治疗中的作用与机制，博士学位论文，共80页，附答辩文稿。
摘要
近些年，肿瘤糖生物学研究逐渐成为肿瘤诊断与治疗领域的新热点。许多研究证明肿瘤的发生发展与糖类分子密切相关。因此，寻找靶向肿瘤相关糖抗原的免疫治疗试剂和方法成为众多研究者的目标。同时，关于肿瘤相关糖抗原的血清学研究也成为人们研究的热点之一。
我们实验室利用抗体差异筛选技术，通过肿瘤细胞和正常/肿瘤组织差异筛选获得一株单克隆抗体，命名为3P9（IgM/κ）。我们用糖生物学和糖芯片的方法研究，发现3P9抗体识别的抗原决定簇不是蛋白质的某一个区域，而是与蛋白质骨架相连的糖链结构，即涎酸化的Tn抗原（sialyl-Tn，简称sTn）。sTn是一个重要的肿瘤相关糖抗原，在上皮来源的肿瘤组织中广泛表达并参与肿瘤发生、发展和转移。那么我们所产生的靶向糖抗原sTn的抗体3P9是否具有抑制肿瘤的生物学活性呢？我们首先在体外利用两对细胞系，结直肠癌细胞系LSCsTn+和LSBsTn-和乳腺癌细胞系MDA-MB-231sTn+和MDA-MB-231sTn-，研究了此抗体的功能。研究发现此抗体能显著抑制sTn阳性细胞的生长和迁移，并能够诱导sTn阳性细胞的凋亡，而对sTn阴性细胞没有任何作用。体内试验也表明，3P9能显著抑制荷sTn阳性肿瘤的小鼠的肿瘤生长。将3P9治疗后的小鼠肿瘤切片，与未治疗（IgM对照）的小鼠肿瘤切片比较发现，治疗组凋亡细胞的数量较未治疗组显著增多，而血管密度较未治疗组显著减少。研究还发现3P9能够介导显著的细胞毒作用。我们的初步研究表明，肿瘤细胞的凋亡很可能是由于抗体3P9与sTn化糖蛋白相互作用，激活了NFκB信号通路，从而引起凋亡蛋白caspase3的激活和抗凋亡蛋白Bcl-2的下调。但具体的信号转导机制如3P9与蛋白表面的糖抗原sTn结合后，究竟是通过哪些接头分子最终激活了NFκB信号通路，从而开启凋亡机制还需要进一步研究。这是我们首次报道抗糖抗原sTn的抗体具有治疗作用，不仅为sTn的疫苗治疗研究提供了可行性依据，而且为治疗性抗体的研发提供了新的选择靶标。
同时我们为结直肠癌，子宫内膜癌等提供了一种新的免疫诊断试剂。为了解3P9在肿瘤组织中的敏感性和特异性，我们收集了737例组织，其中包括18种常见肿瘤类型共573例肿瘤组织和164例相应的正常组织，通过免疫组化的方法筛查了3P9的识别模式。结果表明，3P9在结直肠癌中的敏感性最高（84%），其次是子宫内膜癌（80%）。我们通过对111例子宫内膜癌研究发现，抗体3P9所识别的抗原sTn并非在所有子宫内膜癌中高表达。sTn只在I型子宫内膜癌中高表达（80%），而在II型子宫内膜癌中表达率很低（45%），几乎与sTn在正常组织中的表达率（31%）相近（p﹥0.05）。我们首次报道了sTn与子宫内膜癌的临床病理分型有关，这不仅为I型子宫内膜癌的诊断提供了新的标志分子和诊断试剂，而且对两种类型子宫内膜癌的区别治疗具有指导意义。其次，我们还发现3P9能够区分I型子宫内膜癌的癌前病变，即非典型增生与I型子宫内膜癌。sTn在非典型增生组织中的表达（44%）远远低于I型子宫内膜癌（80%）（p﹤0.01），这在临床诊断上具有重要的指导意义。
我们还发展了一项新技术，以应用于sTn的血清学诊断。在临床上，血清中糖抗原 sTn 及其抗体 3P9 在肿瘤诊断和靶向治疗中的作用与机制循环的sTn化糖抗原又称为CA72-4。目前，CA72-4与CA19-9，CA125，CA15-3一起已经成为临床上较为普遍的糖类肿瘤标记物。这些肿瘤标记物的检测大多数使用的是放射免疫分析法（RIA）或酶联免疫吸附分析法（ELISA）。为了克服这两种方法的不足，如前者价格昂贵，操作过程需要特殊防护，后者检测时间较长，我们发明了一种新的检测方法，这种新方法是基于我们实验室先前发现的磁性纳米颗粒具有过氧化物酶的活性而设计的。具体的方法是将捕获抗体3P6偶联在磁性纳米颗粒上，检测抗体3P9偶联葡萄糖氧化酶（GOD），底物由葡萄糖和3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）组成。葡萄糖氧化酶催化葡萄糖产生过氧化氢，过氧化氢与TMB一起成为磁性纳米颗粒的底物，由其发挥过氧化物酶的活性催化产生颜色反应。在这个新的反应体系中，同时用到磁性纳米颗粒的磁性和过氧化物酶的活性，使抗原的富集，分离和检测都在磁性纳米颗粒上完成，整个反应在液相中进行，大大降低了反应时间。为了验证此系统的可行性，我们用临床血清样品对系统进行了验证，发现此系统与临床检测方法具有一致的检出率。
关键词：sTn化糖蛋白，单克隆抗体3P9，结直肠癌，子宫内膜癌，凋亡，免疫组化，血清检测

目录
摘要 II
Abstract IV
文献综述:肿瘤相关糖抗原与免疫治疗 1
粘蛋白相关的肿瘤糖抗原与免疫治疗 1
lewis血型抗原相关的肿瘤糖抗原与免疫治疗 5
鞘糖脂与免疫治疗 8
唾液酸化的鞘糖脂与免疫治疗 9
混杂糖抗原与免疫治疗 12
可溶性肿瘤相关糖抗原 12
肿瘤相关糖抗原sTn14
研究内容 16
第一部分 糖抗原sTn及其抗体的制备 16
一、材料与方法 17
二、实验结果 20
三、讨论 24
第二部分 糖抗原sTn及其抗体3P9在肿瘤治疗中的作用及机制 25
一、材料与方法 26
二、实验结果 32
三、讨论 42
第三部分 糖抗原sTn及其抗体3P9在肿瘤检测中的应用 44
一、材料与方法 46
二、实验结果 48
三、讨论 57
参考文献 59
在读期间已发表和待发表文章 70
致 谢 71