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粘附分子CD146的抗体及其在疾病检测中的应用，毕业论文，共72页，附答辩文稿。
摘要
细胞粘附分子CD146是一个新近发现的血管内皮细胞标志分子，参与细胞间的粘附及血管新生过程。然而，以不同的CD146抗体为工具对其组织表达谱及生物学功能进行研究时，往往得到不同的结果。例如，抗CD146单抗S-endo1和P1H12均能广泛结合各种血管的内皮细胞；而单抗MUC18只结合毛细血管和高内皮微静脉；我们实验室自制的CD146单抗AA98则特异结合新生血管内皮细胞，特别是肿瘤血管内皮细胞上的CD146分子，而且，AA98具有抑制血管内皮细胞增殖和迁移的活性，可用于以肿瘤血管为靶标的肿瘤靶向治疗，这是已报道的其它CD146抗体都不具备的新特性。分析上述研究结果，我们推测这可能是由于不同的CD146抗体分别识别不同的抗原表位，造成结合谱和功能上的差异。为证明该假设，我们又制备了一组（6株）识别CD146不同表位的单克隆抗体，分别命名为AA1、AA2、AA3、AA4、AA5和AA7，与AA98一起，在分子、细胞和组织水平系统研究了它们的识别表位及组织结合谱，借此阐明CD146介导细胞粘附及血管新生过程的结构学基础，并探讨AA98抑制血管内皮细胞增殖和迁移功能的机制。表位鉴定表明，AA1和AA2识别CD146第24-128位氨基酸之间的肽段；AA3、AA4、AA5和AA7识别的表位位于CD146第335-381位氨基酸之间；AA98则特异识别一个位于CD146 第313-560区段内依赖于二硫键的构象表位。细胞免疫荧光结果显示，AA1、AA2和AA98可以识别活细胞膜表面的CD146分子，而另外4株抗体则不能；与该结果相呼应的是，免疫组化结果显示，AA1、AA2和AA98识别冰冻组织切片上保持天然构象的CD146蛋白，而AA3、AA4、AA5及AA7只识别经甲醛固定而引起表位变化的石蜡组织切片。上述结果提示，AA1、AA2和AA98识别的均是CD146天然构象中的表位，而AA3、AA4、AA5和AA7识别的表位在天然状态的CD146中不存在或不暴露。在分析了上述抗体的识别表位的基础上，进一步的抗体功能研究表明，尽管识别CD146天然构象，但AA1对血管内皮细胞的增殖、粘附和迁移没有影响；只有AA98具有抑制血管内皮细胞的增殖和迁移的活性。这些结果提示我们，AA98识别的抗原表位是CD146介导内皮细胞增殖和迁移的关键结构，首次在表位水平揭示了CD146作用机制的结构学基础。
在上述研究结果的基础上，我们利用抗CD146不同表位的抗体AA1和AA98，建立了新的双抗体夹心ELISA检测体液中可溶性CD146（soluble CD146, sCD146）的系统。过去的研究显示，在慢性肾衰、血管炎等炎性疾病患者血清中的sCD146存在过量表达。而在本研究中，我们利用自己建立的sCD146检测系统，首次在脑脊液中发现了sCD146的存在。不仅如此，进一步对脑脊液sCD146与炎症的相关性研究表明，与正常人脑脊液中的sCD146水平（0.04±0.047nM，n=22）相比，多发性硬化（multiple sclerosis, MS）和急性播散性脑脊髓炎（acute disseminated ence-phalomyelitis, ADEM）等炎症患者的脑脊液sCD146水平明显升高（P﹤0.001），分别为0.31±0.026nM(n=26)和0.358±0.2nM(n=11)。而且，与脑脊液髓鞘碱性蛋白等临床指标的相关性分析显示，脑脊液sCD146水平的变化与疾病进程相关，能够在一定程度上反映脑损害的程度。这些结果提示脑脊液sCD146在MS和ADEM这一类中枢神经系统脱髓鞘病中作为疾病标志物的意义。我们建立的双抗体夹心ELISA检测sCD146的系统可以用于包括MS和ADEM及其它相关疾病的辅助诊断，具有良好的临床应用前景。
在研究慢性炎症疾病sCD146的基础上，以抗体AA98为工具，我们还对膜结合形式CD146在介导炎症过程中的功能进行了研究。我们发现，除表达在血管内皮细胞以外，CD146在系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）等慢性炎症疾病患者中，可以特异地表达于单核细胞表面；对其表达调控机制的研究表明，炎症因子IFN-γ介导的STAT1信号通路可促进CD146分子在单核细胞表面的表达，提示该分子在炎症中发挥作用；机制研究表明，CD146通过介导激活的单核细胞与血管内皮细胞的粘附参与炎症部位单核细胞的募集，而抗体AA98可以抑制该过程。该研究将有助于揭示炎症反应机制，并提供了一株研究炎症反应过程机理和抑制炎症反应的抗体。
关键词：CD146，单克隆抗体，中枢神经系统脱髓鞘病，单核细胞

目录
摘要..............................................................II
Abstract..........................................................IV
文献综述:细胞粘附分子与炎症........................................1
细胞粘附分子................................................1
细胞粘附分子与炎症反应......................................5
可溶性粘附分子..............................................8
细胞粘附分子CD146..........................................11
研究内容..........................................................15
第一部分 CD146不同表位的抗体及其在疾病检测中的应用..............15
一、材料与方法.............................................16
二、实验结果...............................................24
三、讨论...................................................39
第二部分 外周血单核细胞CD146在炎症发生过程中的作用及机制........42
一、材料与方法.............................................43
二、实验结果...............................................46
三、讨论...................................................55
参考文献..........................................................57
在读期间已发表和待发表文章........................................64
致 谢...........................................................65