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硕士论文-奶牛Hsp72单克隆抗体的制备，共77页，39794字
摘 要
利用 DNAStar Protean 软件对 GenBank 上发表的奶牛 Hsp72 完整氨基酸序列的抗原
位点进行分析，选取其中抗原性较好的区域，根据其对应的 DNA 序列设计一对引物，
上下游引物两端分别有 EcoRⅠ和 HindⅢ酶切位点。以从奶牛血中提取的总 DNA 为模
板，用 PCR 方法扩增该基因片段。将扩增得到的基因克隆到 pMD18-T 载体上，构建
pMD18-T/Hsp72 重组质粒，转化 E.coli DH5α，对经蓝白斑筛选和 PCR 鉴定出的阳性克
隆进行序列测定，应用 BLAST 和 DNAStar 软件对所测序列进行分析。利用内切酶
EcoRⅠ和 HindⅢ酶切 pMD18-T/Hsp72 重组质粒，将切下的目的片段插入 pET-32a-c(+)
载体，构建 pET-32a-c(+)/Hsp72 重组质粒，重组质粒经 PCR 和酶切鉴定为阳性后，转
化宿主菌 E.coli BL21。利用 IPTG 诱导表达，并摸索最佳的诱导条件。通过 SDS-PAGE
电泳和 Western blotting 对重组蛋白进行分析和鉴定。利用亲和层析提纯蛋白，免疫
BLAB/C 系小鼠。建立检测奶牛 Hsp72 抗体的间接 ELISA 筛选方法，应用杂交瘤细胞
融合技术将小鼠骨髓瘤细胞 SP2/0 和经重组蛋白（奶牛 Hsp72）免疫过的小鼠脾细胞融
合，利用建立的间接 ELISA 方法对融合细胞进行筛选，选取阳性细胞应用有限稀释法
进行亚克隆。试验结果如下：
1. 用 PCR 方法成功克隆了 541 bp 的奶牛 Hsp72 DNA 片段（GenBank 登录号为
EU038069），经 BLAST 分析，与 GenBank 已发表序列同源性为 99.3%，共有 2 个位点
发生突变，氨基酸序列同源性为 100%，蛋白二级结构分析显示，该蛋白属于可溶性蛋
白，蛋白抗原性好。
2. SDS-PAGE 电泳显示，原核表达产物的分子质量约为 37 kD，与预计大小相符，
对表达重组蛋白进行可溶性分析，证实该蛋白以包涵体和可溶性两种形式存在。最佳诱
导条件为：0.3 mmol/L IPTG，25℃，8 h；经 Western blotting 试验进一步证实，该重组
蛋白具有奶牛 Hsp72 反应原性，命名为“奶牛 Hsp72”。
3. 间接 ELISA 最佳反应条件为：奶牛 Hsp72、商品奶牛 Hsp72 为包被抗原浓度分
别为 1.5 μg/ml，2.0 μg/ml，1%BSA 做封闭液。最佳阳性血清稀释度为 1:1.6×104，Stressgen
Hsp72 单克隆抗体的最佳稀释度为 1:400（2.5 μg/ml），抗原抗体反应时间为 90 min，1%
BSA 作为封闭液，含 0.5%的吐温-20 作为洗涤液。羊抗小鼠 IgG-HRP 最佳稀释度为 1:3
×104（6.7×10-2 μg/ml），作用时间为 60 min。细胞融合后能够筛选到阳性克隆，细胞
融合成功。但克隆后没有检测到阳性孔；重复亚克隆三次，依然没有检测到阳性孔。
关键词：奶牛；Hsp72；PCR；原核表达；单克隆抗体
目 录
中文摘要 1
英文摘要 3
缩略符号 ...............Ⅰ
文献综述 1
1 前言 .... 1
2 热休克蛋白与热休克蛋白 70 .............. 1
2.1 热休克蛋白概述 ............... 1
2.2 热休克蛋白 70 概述 ......... 2
3 体外基因表达技术研究现状 ............... 6
3.1 原核基因表达系统 ........... 7
3.2 真核基因表达系统 ........... 9
4 单克隆抗体制备研究进展 11
4.1 DNA 免疫制备单克隆抗体 .............. 11
4.2 细胞免疫制备单克隆抗体 .............. 12
4.3 多位点重复免疫制备单克隆抗体... 12
研究内容
试验一 奶牛 Hsp72 基因片段的克隆及鉴定 ....... 14
1 试验材料 ........... 14
1.1 奶牛 Hsp72 完整氨基酸序列 .......... 14
1.2 主要试剂 ........ 14
1.3 仪器设备 ........ 14
1.4 菌株和载体 .... 14
1.5 奶牛血液 ........ 15
2 试验方法 ........... 15
2.1 奶牛 Hsp72 二级结构及抗原位点分析 ........... 15
2.2 引物的设计与合成 ......... 15
2.3 牛血总 DNA 的提取....... 15
2.4 奶牛 Hsp72 基因片段的扩增 .......... 15
2.5 奶牛 Hsp72 基因片段的克隆与序列分析 ....... 16
3 结果 .. 19
3.1 奶牛 Hsp72 二级结构及抗原位点分析结果 .... 19
3.2 PCR 扩增结果 . 20
3.3 单菌落 PCR 结果 ............ 20
3.4 质粒酶切鉴定 21
3.5 测序结果分析 21
3.6 Hsp72 基因片段的二级结构分析 .... 23
4 讨论 .. 24
试验二 奶牛 Hsp72 基因片段在 E.coli BL21 中的表达及纯化......... 25
1 试验材料 ........... 25
1.1 主要试剂 ........ 25
1.2 仪器设备 ........ 25
1.3 菌株和载体 .... 25
2 试验方法 ........... 25
2.1 奶牛 Hsp72 基因片段原核表达载体的构建与鉴定 ........ 25
2.2 奶牛 Hsp72 基因片段在 E.coli BL21 中表达及表达条件的优化 .... 28
2.3 重组蛋白免疫印迹分析（Western blotting） . 30
2.4 奶牛 Hsp72 的纯化 ......... 31
3 结果 .. 31
3.1 奶牛 Hsp72 基因片段原核表达载体的鉴定结果 ............ 31
3.2 奶牛 Hsp72 基因片段在 E.coli BL21 中的表达及表达条件的优化结果 ......... 33
3.3 免疫印迹（Wesern blotting）结果 . 35
3.4 奶牛 Hsp72 的纯化结果 . 36
4 讨论 .. 36
试验三 抗奶牛 Hsp72 单克隆抗体制备的初步研究............. 39
1 试验材料 ........... 39
1.1 抗原 ................ 39
1.2 试验动物和骨髓瘤细胞 . 39
1.3 主要试剂 ........ 39
1.4 仪器设备 ........ 39
2 试验方法 ........... 40
2.1 抗原的制备 .... 40
2.2 动物的免疫 .... 40
2.3 间接 ELISA 筛选方法的建立 ......... 40
2.4 杂交瘤细胞株的建立 ..... 41
2.5 阳性杂交瘤细胞的筛选 . 42
2.6 阳性杂交瘤细胞的亚克隆 .............. 43
3 结果 .. 43
3.1 动物的免疫及免疫效价的测定结果................ 43
3.2 间接 ELISA 检测方法的建立 ......... 43
3.3 杂交瘤细胞株的建立 ..... 43
4 讨论 .. 44
结论 ............... 46
参考文献 ............... 47
致谢 ............... 53
附录 ............... 54
攻读硕士学位期间发表的学术论文 ..... 62