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硕士论文-中国荷斯坦奶牛hsp70基因和chip基因多态性对热应激影响研究，共68页，37535字
摘 要
奶牛热应激一直影响着奶牛业的发展．给奶牛业造成严重损失。HSP70作为
分子伴侣在正常和应激条件下对机体的生理机能发挥重要作用，CHIP具有E3泛
素链接酶活性，与分子伴侣HSP70相互作用在泛素蛋白酶降解系统中发挥重要作
用。本试验选择了中国荷斯坦牛为试验材料，以hsp70基因和chip基因作为功能
候选基因进行研究，通过单核苷酸多态性和统计模型分析，以期为中国荷斯坦牛
育种提供分子标记辅助选择的依据。试验采集427头系谱资料齐全、生产记录完
整的中国荷斯坦牛血样，并采集两头身体健康的荷斯坦奶牛的组织，包括心脏，
肌肉，肝脏，脾脏和肾脏。利用PCR-SSCP, PCR-RFLP,CRS-RFLP技术对HSP70
基因和CHIP基因的多态性进行研究，利用FQ-PCR技术检测chip和hsp70基因在不
同组织中的mRNA表达水平。
对hsp70基因外显子部分序列进行扩增，测序结果表明：在1524位点发现G/A
突变，但未导致所编码的氨基酸序列发生改变。PCR-RELP结果发现AA，AB两
种基因型，A等位基因占主要优势，属于低度多态，不是理想的分子标记。群体
遗传学分析表明，该位点达到Hardy-Weinberg平衡状态(P＞0.05)。扩增chip全基
因序列，在719位点第一内含子上发现C/T突变，在1014位点第二内含子上发现T
缺失，1407位点第四外显子上发现T插入并引起所编码的氨基酸179位置移码突
变。1014位点T缺失无酶切位点进行检测。PCR-RELP，CRS-RFLP结果发现719，
1407两个位点均存在三种基因型，A、B两种等位基因所占比例均近似相同。群
体遗传学分析表明这两个位点未达到Hardy-Weinberg平衡状态(P＜0.05)，在所研
究的群体中，处于中度多态。FQ-PCR结果表明，hsp70基因mRNA在肝脏中表达
最高，chip基因mRNA在心脏中表达最高，三个位点中只有chip基因1407位点在
两头牛中存在不同基因型，分别是AB、BB型，其中BB型个体CHIP表达量高于
AB基因型个体。
利用SAS 8.0软件，对hsp70和chip基因的3个多态位点的基因型与直肠温度和
红细胞钾浓度进行相关分析。结果表明：hsp70基因1524位点AA型个体红细胞浓
度显著高于AB型个体，但该位点属于低度多态所以有待于扩大样品量进行证实；
chip基因719位点不同基因型对直肠温度和红细胞钾浓度没有显著差异，1407位
点不同基因型的直肠温度没显著差异，而对红细胞钾浓度BB基因型显著低于AA
和AB两个基因型。通过以上结果说明chip基因1407位点BB基因型个体可能会有
更好的抗热应激潜力。
关键词：hsp70；chip；热应激；多态性；荧光定量PCR
目录
摘要 ...... 1
Abstract 1
前言 ...... 1
1.文献综述 ...... 1
1.1 奶牛热应激的研究进展 1
1.1.1 奶牛热应激的概述 ..... 1
1.1.2 热应激对奶牛的影响 . 2
1.1.3 热应激对生产性能的影响..... 2
1.1.4 热应激对繁殖性能的影响..... 3
1.1.5 热应激对机体免疫机能的影响........ 3
1.1.6 奶牛耐热遗传生化标记主要研究.... 3
1.1.7 热应激防治措施的研究 ........ 4
1.2 HSP70 蛋白的研究进展. 4
1.2.1 热休克蛋白的特点 ..... 4
1.2.2 hsp70 基因的特点........ 5
1.2.3 hsp70 生物学功能........ 5
1.3 CHIP 的研究进展 .......... 7
1.3.1 chip 基因及蛋白的特点 ......... 7
1.3.2 CHIP 与 HSPs 的相互作用 ... 8
1.3.3 CHIP 的泛素连接酶活性....... 8
1.3.4 CHIP 在退行性疾病中的作用.......... 9
1.3.5 CHIP 在蛋白质量控制体系中的作用....... 10
1.4 研究的主要内容 .......... 10
2. 材料与方法 ..........11
2.1 试验材料 .11
2.1.1 试验动物 .........11
2.1.2 主要仪器设备与耗材 11
2.1.3 试验主要试剂及配置 .......... 12
2.1.4 主要分子生物学软件 .......... 13
2.2 试验方法和步骤 .......... 13
2.2.1 奶牛 DNA 的提取..... 13
2.2.2 基因组 DNA 浓度和纯度的检测... 14
2.2.3 荷斯坦牛耐热性指标的测定.......... 14
2.2.4 基因的 PCR 扩增 ..... 15
2.2.5 PCR-SSCP 分析 ........ 17
2.2.6 测序 ..... 18
2.2.7 RFLP 分析 ...... 19
2.2.8 数据统计分析 19
2.2.9 hsp70 和 chip 基因各多态位点与奶牛热应激性状之间的相关性...... 21
2.2.10 FQ-PCR 检测 hsp70 和 chip 基因 mRNA 表达水平... 21
3 结果分析 .... 26
3.1 中国荷斯坦奶牛 hsp70 和 chip 基因多态性检测结果与分析.... 26
3.1.1 基因组 DNA 的提取. 26
3.1.2 PCR 扩增结果 26
3.1.3 chip 基因和 hsp70 基因 PCR-SSCP 和测序结果 .......... 29
3.1.4 hsp70 和 chip 基因多态位点 RFLP 结果 . 31
3.1.5 hsp70 和 chip 基因各位点基因及基因型频率分析........ 32
2
3.2 hsp70 和 chip 基因多态性与热应激性状的关联分析....... 33
3.3 荧光定量 PCR 检测 hsp70 和 chip mRNA 在组织中的表达结果与分析...... 34
3.3.1 总 RNA 提取质量和纯度.... 34
3.3.2 RT-PCR 扩增和重组质粒的鉴定 ... 34
3.3.3 标准曲线的建立 ....... 35
3.3.4 不同组织不同基因型中 mRNA 表达差异.......... 36
4.讨论 . 37
4.1 几种 SNPs 检测方法的比较 .. 37
4.1.1 PCR-SSCP ...... 37
4.1.2 PCR-RFLP...... 37
4.1.3 CRS-RFLP...... 38
4.2 PCR 反应体系与反应条件的优化 .... 39
4.2.1 关于引物 ........ 39
4.2.2 关于模板的质量 ....... 39
4.2.3 关于引物的退火温度 .......... 39
4.2.4 关于 PCR 产物污染 . 40
4.3 直肠温度和红细胞钾浓度作为耐热性指标的可行性分析......... 40
4.4 FQ-PCR 反应的优化 ... 41
4.4.1 FQ-PCR 标准品的构建 ....... 41
4.4.2 FQ-PCR 引物设计 .... 41
4.4.3 关于 FQ-PCR 假阳性和假阴性的问题 ... 41
4.4.4 关于 FQ-PCR 方法的优点 . 42
4.5 hsp70 和 chip 基因多态性与荷斯坦牛耐热性关系的分析.......... 42
5.总结 . 44
参考文献 ....... 45
致谢 .... 51
个人简介 ....... 52