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硕士论文-猪附红细胞体部分生物学特性及诊断方法的研究，共60页，29816字
摘要
1.对确诊为附红细胞体感染的猪无菌采集抗凝血，纯化附红细胞体及其基因组 DNA，
根据已报道的猪附红细胞体 16S rRNA 基因序列设计了一对特异性引物，进行 PCR 扩增，
结果扩增出了 421bp 的猪附红细胞体片断，然后对扩增产物进行克隆和测序，所测序列
已登录 GenBank（序列号为 DQ223958），并同已发表的进行同源性分析，结果表明同源
性为 74.8%，进一步的验证确认该序列是猪附红细胞体的 16S rRNA 基因的部分序列。
2.用抗猪附红细胞体的单克隆抗体，通过 IFA 方法对 48 份疑似猪附红细胞体感染
的病猪血液进行间接免疫荧光检测，并与镜检及 PCR 检测方法进行比较，结果显示 IFA
检测的阳性率为 62.5%，与 PCR 检测阳性率为 64.59%基本相符，比血涂片的瑞氏和姬姆
萨染色镜检阳性率高出近 30 个百分点；而用猪肺炎支原体、猪链球菌和猪巴氏杆菌作
的对照结果均阴性。
3.参照猪附红细胞体 16S rRNA 的基因序列，设计引物，分别以标准株和分离株的
基因组 DNA 为模板，建立 SYBR Green I 实时荧光定量 PCR 方法检测猪附红细胞体病原，
确定特异性产物的 Tm 值，同时做普通 PCR。结果表明：该试验特异性产物的 Tm 值为
88.5℃，该法能检测到阳性质粒标准品的最低浓度为 0.027fg/μL。以阳性质粒标准品
10 倍倍比稀释的模板进行实时荧光定量 PCR，通过对反应体系和反应条件进行筛选和优
化，最终建立了检测猪附红细胞体的标准曲线。
关键词：猪附红细胞体；PCR；IFA；单克隆抗体；实时荧光定量 PCR；SYBR Green I
目 录
中文摘要 ...... 1
英文摘要 ...... 2
符号说明 ....... I
前言 .. 1
文献综述 ...... 2
1 种属分类... 2
2 基因组的结构特征........... 3
3 生物学特性........... 3
3.1 运动特性. 3
3.2 理化特性 3
3.3 染色特性 3
4 培养特性... 4
5 人兽共患感染....... 4
6 诊断方法... 5
6.1 显微镜诊断........ 5
6.2 血清学诊断........ 6
6.3 分子生物学诊断 6
试验研究 ...... 8
试验一 猪附红细胞体部分生物学特性的研究... 8
1 试验材料... 8
1.1 材料........ 8
1.2 仪器设备 8
2方法......... 8
2.1 压片镜检猪附红细胞体 8
2.2 染色镜检猪附红细胞体 8
2.3 猪附红细胞体对 BHK 细胞生长的影响 ......... 9
3结果......... 9
3.1 猪附红细胞体压片镜检结果.... 9
3.2 猪附红细胞体染色镜检结果.. 10
3.3 猪附红细胞体感染 BHK 细胞的镜检结果 ... 10
4讨论....... 11
试验二
猪附红细胞体 PCR 诊断方法的建立 .. 12
1 试验材料. 12
1.1 材料...... 12
1.2 仪器设备.......... 12
2方法....... 13
2.1 病原的分离纯化.......... 13
2.2 猪附红细胞体 DNA 的提取 ... 13
2.3 引物的设计与合成...... 13
2.4 PCR 反应体系 .. 13
2.5 PCR 扩增产物的检测 .. 14
2.6 猪附红细胞体 16S rRNA 部分基因的克隆 ... 14
2.7 阳性重组子的筛选与鉴定...... 15
2.8 序列测定.......... 15
2.9 序列分析及同源性比较.......... 15
2.10 气味黄杆菌的排除.... 16
2.11 最佳退火温度的筛选 18
2.12 特异性试验.... 18
2.13 敏感性试验.... 18
3结果....... 18
3.1 PCR 电泳及测序结果 .. 18
3.2 气味黄杆菌的排除结果.......... 19
3.3 质粒 PCR 的测定结果 21
3.4 最适退火温度测定结果.......... 21
3.5 PCR 特异性测定结果 .. 22
3.6 PCR 敏感性测定结果 .. 22
讨论....... 23
试验三
猪附红细胞体间接免疫荧光诊断方法的建立与应用. 25
1 试验材料. 25
1.1 材料...... 25
1.2 仪器设备.......... 25
2方法....... 25
2.1 标准阳性抗原和阴性抗原对照的设立 .......... 25
2.2 包被抗原.......... 25
2.3 荧光二抗的稀释.......... 25
2.4 IFA 测定 ........... 26
2.5 荧光抗体及单克隆抗体最佳稀释浓度的确定 .......... 26
2.6 IFA 特异性检测 ........... 26
2.7 临床样品的检测.......... 26
3结果....... 26
3.1 荧光抗体最佳浓度的测定结果 .......... 26
3.2 单克隆抗体最佳浓度的测定结果...... 27
3.3 IFA 的特异性及敏感性检测结果........ 27
3.4 临床检测结果.. 27
4讨论....... 28
试验四 猪附红细胞体荧光定量 PCR 诊断方法的建立与应用 29
1 试验材料. 29
1.1 材料...... 29
1.2 仪器设备.......... 29
2方法....... 29
2.1 猪附红细胞体病原的分离纯化 .......... 29
2.2 猪附红细胞体 DNA 的提取 ... 30
2.3 引物的设计与合成...... 30
2.4 普通 PCR ......... 30
2.5 阳性质粒标准品的制备.......... 30
2.6 实时荧光定量 PCR 的检测 .... 30
2.7 猪附红细胞体分离株的检测.. 30
2.8 实时荧光定量 PCR 检测的敏感性检测 ........ 30
2.9 标准曲线的制作.......... 31
2.10 临床样品的检测........ 31
3结果....... 31
3.1 普通 PCR 结果 31
3.2 实时荧光定量 PCR 检测分离株的结果 ....... 32
3.3 实时荧光定量 PCR 敏感性检测结果 32
3.4 标准曲线的建立.......... 33
3.5 临床样品的检测结果.. 34
4讨论....... 34
全文总结 .... 36
参考文献 .... 37
附图 41
附录 42
致谢 44