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肿瘤细胞迁移过程中CD146的功能及作用机理研究，博士学位论文，共67页，附答辩文稿。
摘 要
细胞粘附分子CD146 是黑色素瘤的标志分子，在肿瘤细胞的迁移过程中发挥着重要的功能，但其作用机理尚不清楚。针对这一问题，本论文分别从与CD146胞外区结合的上游分子以及CD146 胞内区的下游结合蛋白两个方面探讨了CD146 在细胞迁移中发挥作用的分子机制。
通过免疫共沉淀实验我们首次证明了CD146 可以与actin 结合，并且发现这种结合是通过膜突蛋白Moesin 介导的。免疫荧光的结果显示，CD146-Moesin 复合物在运动中的细胞内呈现极性分布，并主要集中于丝状伪足等与细胞的运动功能密切相关的区域。下调CD146 的表达或竞争抑制Moesin 的功能均可以导致丝状伪足的长度及数量的减少，并且显著抑制黑色素瘤细胞的迁移。除了直接与Moesin 结合，CD146 还可以引起Moesin 的活化，具体表现为Moesin 磷酸化水平的升高及膜定位与极性分布的增强。使用Moesin 的上游分子ROCK 及p38MAPK 的抑制剂不能抑制这一现象，说明CD146 可能通过PKC 或其它信号通路来促进Moesin 的活化。我们的研究提出了CD146 促进黑色素瘤细胞迁移的一个可能机制：即CD146 通过上调Moesin 的磷酸化，一方面促进了Moesin 与CD146及其它粘附分子的结合，并藉此介导细胞膜与细胞骨架的相互作用，促进细胞的极化；另一方面活化的Moesin 可以促进Rho GTPases 的活化，由此引发actin 细胞骨架的重排，最终促进细胞的迁移。
除了寻找下游蛋白，对CD146 上游结合分子的鉴定也是探讨CD146 作用机理必不可少的一部分。我们以CD146 的胞外区片段（sCD146）作为探针，通过Far-Western Blot 实验检测了其与A375、Mel888+和ECV304 细胞内蛋白的结合情况，发现sCD146 可以识别一个分子量约130 kD 的蛋白。进一步通过His-tag pulldown 实验发现该蛋白是细胞自身表达的CD146。这表明CD146 具备同亲性相互作用的能力。这一发现与CD146 所属的免疫球蛋白超家族中部分成员同时具有同亲性及异亲性结合活性的特点相一致。
和很多粘附分子类似，CD146 也同时存在可溶型及膜结合型两种形式。研究表明，外周血、脑脊液中可溶型CD146 的含量与一些自身免疫疾病息息相关。
在利用CD146 抗体AA98 建立临床样品中可溶型CD146 的检测方法时，我们意外发现通常被认为化学反应惰性的Fe3O4 磁性纳米颗粒（MNPs）具有类似过氧肿瘤细胞迁移过程中CD146 的功能及作用机理研究化物酶的催化活性，并进一步将这种催化活性应用于有毒有害物质的氧化和降解中。该方法具有成本低廉、稳定性好、无二次污染以及可回收反复使用的优点，在环境保护及工业生产等多个领域具有广泛的潜在应用价值。
关键词：CD146，Moesin，actin，磷酸化，肿瘤细胞迁移

目 录
中文摘要 I
英文摘要 Ⅲ
目录 Ⅴ
文献综述
第一部分 ERM 的结构与功能 1
1 ERM 的结构特征与构象转换 1
2 与ERM 有关的信号通路 3
3 ERM 可以与多种膜蛋白结合 5
4 问题与展望 6
第二部分 粘附分子CD146 与细胞迁移 8
1 CD146 的结构与功能 8
2 CD146 的作用机理 9
3 寻找CD146 配体的研究 10
3 问题与展望 11
研究内容
第一部分 CD146 在肿瘤细胞迁移中的作用机理研究 12
1 材料与方法 13
2 实验结果 18
3 讨论 30
第二部分 CD146 配体的研究 32
1 材料与方法 33
2 实验结果 35
3 讨论 38
第三部分 磁性纳米颗粒的催化活性研究 40
1 材料与方法 41
2 实验结果 43
3 讨论 53
参考文献 54
发表文章 60
致谢 61