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毕业论文-蛋白M胞内转运的分子作用机理研究，共62页，19404字
中文摘要
蛋白 M 是真核细胞核仁中含量较高的一种非组胺磷酸蛋白，具有多种生物
学功能，如调控核糖体的装配与成熟。近年来报道蛋白 M 还具有在细胞核、胞
质、胞膜间穿梭的特性，表达于细胞膜上的蛋白 M 可作为多种蛋白分子、细菌、
病毒等的受体与配体。但目前对蛋白 M 的胞内转运机制研究较少，根据现有研
究结果难有定论。
本文从蛋白 M 的磷酸化修饰和蛋白 M 的相互作用蛋白两方面对蛋白 M 胞
内转运的分子机制进行研究。首先通过质谱分析鉴定得到特定的磷酸化修饰位
点丝氨酸 67 位点和相互作用蛋白 Hc。在磷酸化修饰方面，通过模拟丝氨酸 67
位点磷酸化或利用激酶抑制剂改变整体磷酸化水平，研究蛋白 M 磷酸化修饰与
其转运的关系，初步证明多点磷酸化状态变化对蛋白 M 的转运有一定影响。在
蛋白 M 的相互作用蛋白方面，首先通过 siRNA 干扰证明了蛋白 Hc 可调控蛋白
M 的胞内转运，继而通过免疫共沉淀证明此作用经由蛋白-蛋白相互作用完成，
结合位点位于蛋白 M 的 N 端结构域和蛋白 Hc 的 PBD 结构域内，并进一步发现
蛋白 Hc 在转运过程中有稳定蛋白 M、并调控其与非肌型肌球蛋白重链 9 相互作
用的功能。该文章为进一步阐明蛋白 M 的胞内转运机制提供了更多证据与思路。
关键词： 蛋白 M；胞内转运；磷酸化修饰；蛋白 Hc；蛋白相互作用

ABSTRACT
Protein M is a multifunctional nonhistone protein located predominantly in the
nucleolus and has several different essential functions, such as organizing nucleolar
chromatin and packaging pre-RNA. Discoveries in the last few years have revealed
that Protein M can also present in cytoplasm, and even on the surface of some types
of cells, serving as a receptor or a ligand for a plenty of proteins, bacteria, virus and
etc. However, the molecular mechanism of protein M translocation still remains
unclear.
This thesis preliminarily elucidates the molecular mechanism of protein M
translocation from two aspects: the phosphorylation of protein M and the interacting
protein of protein M. By LC-mass, we first figured out that the phosphorylation status
of Ser-67 of protein M was different in different cell components, and identified
protein Hc as one of protein M’s interacting proteins. In order to investigate the
influence of phosphoryation, we studied Ser-67 as a specific site by mimicking its
phosphorylation or de-phosphorylation status, as well as the overall phosphorylation
level through also using kinase inhibitors, proving that phosphorylation of protein M
influences its translocation. As for the interaction between protein M and protein Hc,
we found that protein Hc could regulate the translocation of protein M, and reports
that this function is through direct protein-protein interaction through N-terminal
domain of protein M and PBD domain of protein Hc. Furthermore, we discovered
that protein Hc could stabilize protein M during its translocation, and regulate the
interaction between protein M and MyH9. This thesis provides more evidences and
insights in elucidating the molecular mechanism of protein M translocation.
Keywords:proteinM;translocation;phosphorylation;proteinHc;protein-protein interaction

目 录
第 1 章
引 言 ..... 1
1.1 研究背景.... 1
1.1.1 蛋白M的结构与功能 .......... 1
1.1.2 蛋白M的细胞膜定位 .......... 2
1.1.3 细胞膜表面蛋白M的功能.. 2
1.1.4 蛋白M的磷酸化修饰 .......... 3
1.1.5 蛋白Hc介绍 ... 4
1.2 课题主要内容及研究意义 ....... 5
1.2.1 课题内容 ........ 5
1.2.2 研究意义 ........ 5
第 2 章 实验材料与技术 ........ 6
2.1 实验材料.... 6
2.1.1 细胞...... 6
2.1.2 细胞培养基 .... 6
2.1.3 实验主要试剂 6
2.1.4 PCR引物及siRNA序列....... 7
2.1.5 实验仪器 ........ 7
2.2 溶液体系.... 8
2.2.1 细胞培养基 .... 8
2.2.2 分细胞组分相关溶液 ......... 8
2.2.3 免疫沉淀相关溶液... 8
2.2.4 SDS-PAGE 相关溶液 ........ 9
2.2.5 分子生物学相关 ....... 9
2.2.6 免疫荧光相关溶液. 10
2.2.7 免疫印迹相关溶液. 11
2.3 实验方法.. 11
2.3.1 细胞培养与传代 ..... 11
2.3.2 细胞组分分离 ......... 12
2.3.3 免疫沉淀 ...... 12
2.3.4 SDS-PAGE ... 12
2.3.5 PCR .... 13
2.3.6 琼脂糖凝胶电泳DNA回收 ......... 13
2.3.7 酶切连接 ...... 14
2.3.8 大肠杆菌感受态细胞化学转化 .. 14
2.3.9 菌落PCR....... 15
2.3.10 质粒小量提取 ......... 15
2.3.11 转染六孔板（十二孔板） .......... 16
2.3.12 质粒大量提取 ......... 16
2.3.13 DAPI染色 ..... 17
2.3.14 FACS.. 18
2.3.15 转染siRNA ... 18
2.3.16 免疫印迹 ...... 18
第 3 章 蛋白M磷酸化修饰及相互作用蛋白 对其胞内转运的影响 20
3.1 实验原理.. 20
3.2 实验结果.. 20
3.2.1 细胞组分的分离与蛋白M及其相互作用蛋白的提取......... 20
3.2.2 质谱鉴定不同组分中蛋白M丝氨酸 67 位点磷酸化状态 .. 21
3.2.3 质谱鉴定胞浆、胞膜中与蛋白M相互作用的蛋白 .. 22
3.3 实验结论.. 23
第 4 章 蛋白M丝氨酸 67 位点磷酸化修饰 对蛋白M胞内转运的影响 ..... 24
4.1 实验原理.. 24
4.2 实验结果.. 24
4.2.1 丝氨酸 67 位点突变体的构建 .... 24
4.2.2 丝氨酸 67 位点磷酸化对蛋白M胞内转运的影响 .... 26
4.3 实验结论.. 26
第 5 章 激酶抑制剂对蛋白M胞内转运的影响 .. 27
5.1 实验原理.. 27
5.2 实验结果.. 27
5.2.1 激酶抑制剂影响细胞膜表面蛋白M的表达 ... 27
5.3 实验结论.. 29
第 6 章 蛋白Hc参与蛋白M的胞内转运 ... 30
6.1 实验原理.. 30
6.2 实验结果.. 30
6.2.1 蛋白Hc对蛋白M向细胞膜转运的影响 30
6.2.2 胞内蛋白Hc的表达对蛋白M向细胞膜上转运的影响 ........ 33
6.3 实验结论.. 34
第 7 章 蛋白M与蛋白Hc的相互作用位点 .......... 35
7.1 实验原理.. 35
7.2 实验结果.. 35
7.2.1 蛋白M与蛋白Hc有直接相互作用 ........ 35
7.2.2 蛋白M与蛋白Hc结合的结构域.. 36
7.2.3 蛋白Hc与蛋白M结合的结构域.. 38
7.2.4 蛋白M与蛋白Hc PBD结构域片段细胞内共定位..... 39
7.3 实验结论.. 40
第 8 章 蛋白Hc调控蛋白M的胞内转运 ... 41
8.1 实验原理.. 41
8.2 实验结果.. 41
8.2.1 蛋白Hc可稳定细胞内蛋白M...... 41
8.2.2 蛋白Hc调控蛋白M与MyH9 间的相互作用 ... 42
8.3 实验结论.. 42
第 9 章 结论与未来展望 ...... 43
9.1 结论总结.. 43
9.2 实验讨论.. 43
9.3 未来展望.. 44
插 图 索 引 45
表 格 索 引 46
参 考 文 献 47
致 谢... 49
声 明... 50
附录A 外文资料的调研阅读报告 .... 51