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硕士论文-H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白基因分子流行病学研究，共113页，39119字
摘 要
H9N2 亚型禽流感是目前我国流行范围最广泛，危害最大的低致病性禽流感，自从
1994 年在我国首次分离以来，其流行范围已涉及我国大部分的省市、地区。本实验对
1998 年以来在我国大陆地区流行的 47 株 H9N2 亚型禽流感病毒进行了分离。我们对这些
毒株进行了流行和演化规律的研究以及免疫原性的研究，从分子流行病学角度和血清学
角度对我国流行的 H9N2 亚型禽流感病毒的防制提供参考和依据。
试验一、47 株 H9N2 亚型禽流感病毒 HA 蛋白基因流行演化规律的研究
本试验对 1998-2008 年覆盖我国东北、华北、华东、华南、西南及华中等地区的 47
株 H9N2 亚型禽流感分离株进行了 HA 蛋白全基因序列扩增及测序。研究发现：在中国大
陆流行的 H9N2 亚型禽流感既有欧亚分支的毒株也有美洲分支的毒株，而且我国大陆地
区流行的欧亚分支毒株只集中在 A /Duck/Hong Kong /Y280/97(H9N2)亚分支中。中国大
陆地区欧亚分支株的分离株亲源关系在 86.8%-99.9%之间，美洲分支毒株与欧亚分支株
的亲缘性在 80.7%-89.1%之间。这些分离株的裂解位点氨基酸序列均符合低致病性禽流
感的氨基酸序列特征。有部分毒株在 218-220aa 处缺少潜在的糖基化位点，HA 蛋白的受
体结合位点的氨基酸序列除 198 位变异比较大外，其余位置均比较保守。我国部分地区
流行 H9N2 禽流感呈现一定的规律性。
试验二、H9N2 亚型禽流感病毒 HA 蛋白氨基酸差异与病毒抗原性差异的比较研究
本试验从全国各地分离到的 47 株 H9N2 亚型禽流感病毒中挑选出有代表性的 12 株，
对这些毒株的 HA 基因进行了序列测定，并推倒出其 HA 蛋白氨基酸序列。用分子生物学
软件比较这些 HA 蛋白的氨基酸序列的差异。用 SPF 鸡制备出这些毒株的免疫血清，通
过交叉 HI 试验，计算出不同毒株间的抗原相关系数。通过对 HA 蛋白氨基酸序列的分析
及抗原相关性的分析，我们发现这些毒株在抗原位点处，在第 183 位和 188 位氨基酸有
所差异。通过对 HA 蛋白氨基酸序列差异性和抗原性差异的分析我们发现，二者呈正相
关。HA 蛋白氨基酸序列差异达到一定程度却可以造成抗原性的改变，当 HA 蛋白氨基酸
序列差异大于 7%时，抗原性的改变比较明显，而当 HA 蛋白氨基酸序列差异小于 3.6%时，
抗原性无明显差异。
试验三、H9N2亚型禽流感引起的鸡群生理指标变化分析
通过测定H9亚型禽流感发病鸡群及健康鸡群的某些生理指标，发现H9亚型禽流感疾
病状态下皮质醇激素、FT3甲状腺激素和血清钙的水平均呈明显变化，而生长激素、FT4
甲状腺激素和血清磷无明显差异。这些变化是由于机体对疾病的抵抗或代谢紊乱产生
的，可以作为疾病诊断的依据。
关键词：H9N2；流行和演化；免疫原性；免疫保护；生理指标
目录
摘 要......... 1
Abstract ..... 3
文献综述... 5
1.流感病毒的病原学 ...... 5
1.1 禽流感病毒基因组 ..... 6
1.2 血凝素(Hemagglutinin,HA)蛋白的功能及与其有关的病毒特性 .. 6
1.3 禽流感病毒的变异 ... 10
1.4 H9N2 AIV的分子演化 ....... 11
2 .H9 亚型禽流感病毒的流行病学及临床剖检症状 ... 11
3.流感病毒的疫苗免疫 13
3.1 全病毒灭活疫苗 ....... 13
3.2 弱毒疫苗 ......... 14
3.3 亚单位疫苗 ..... 14
3.4 重组活载体疫苗 ....... 15
3.5 核酸疫苗 ......... 16
4.本研究的目的意义及拟解决的问题 ...... 16
试验一、47 株H9N2 亚型禽流感病毒HA蛋白基因流行演化规律的研究 ...... 18
1.材料方法 18
1.1 病毒、鸡胚、菌种及标准阳性血清 .... 18
1.2 引物 ....... 20
1.3 主要仪器 ........ 20
1.4 主要试剂 ......... 20
1.5 分子生物学软件 ...... 20
1.6 RNA的提取 .... 20
1.7 病毒cDNA的获取.... 21
1.8 PCR扩增及产物的纯化 ..... 21
1.9 HA基因的克隆 ......... 22
2.试验结果 25
2.1HA基因cDNA 的RT-PCR扩增..... 25
2.2 序列测定结果 26
2.3 HA基因系统发育进化树 ... 27
2.4 中国大陆地区及香港地区HA基因系统进化关系 .. 29
2.5 HA蛋白基因核苷酸序列分析 ..... 30
2.6 HA蛋白重要位点氨基酸序列分析 ....... 31
3.讨论........ 32
3.1 H9N2 亚型禽流感毒株遗传进化关系分析 .... 32
3.2 H9N2 亚型禽流感病毒流行特点分析 .. 34
4.结论........ 37
试验二、H9N2 亚型禽流感病毒HA蛋白氨基酸差异与病毒抗原性差异的比较研究 ....... 38
1.材料和方法 ...... 38
1.1 毒株HA蛋白氨基酸序列进化树的建立及免疫用毒株的选取... 38
1.2 HA蛋白特殊位点氨基酸序列 ..... 39
1.3 不同毒株免疫血清的制备 . 40
1.4 交叉血凝抑制试验 ... 40
2 结果....... 41
2.1 HA基因的RT-PCR扩增 ...... 41
2.2 HA蛋白序列的比较分析 ... 41
2.3 特殊位点氨基酸序列分析 42
2.4 交叉血凝抑制试验结果 .... 43
2.5 HA蛋白氨基酸序列差异与抗原性差异相关性的分析... 43
3 讨论....... 44
3.1 不同AIV毒株的HA蛋白氨基酸差异及抗原性差异的分析 ....... 44
3.2 HA蛋白氨基酸序列差异与抗原性差异的比较分析 ......... 45
4.结论........ 46
试验三、H9 亚型禽流感引起的鸡群生理指标变化分析 ... 47
1.材料与方法 ...... 48
1.1 材料及试剂 .... 48
1.2 病鸡群及健康对照鸡群血清的采集及处理 ... 48
1.3 体液生理指标的测定 ......... 48
1.4 数据处理和分析 ....... 48
2.结果........ 48
3. 讨论...... 49
3.1 皮质醇 ... 49
3.2 生长激素 ......... 49
3.3 FT3、FT4........ 49
3.4 血钙、血磷 ..... 50
4.结论........ 50
本文的创新点... 51
结论......... 51
附表......... 52
1.HA基因核苷酸序列 .. 52
2.HA蛋白氨基酸序列 .. 81
附图......... 91
1.病鸡症状 91
2.病死鸡剖检典型病变 92
2.1 气管 ....... 92
2.2 支气管 ... 93
2.3 肺部 ....... 93
2.4 气囊 ....... 94
2.5 肾 . 94
2.6 腺胃 ....... 95
2.7 小胸肌 ... 95
参考文献. 96
致谢. 103