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肌醇对幼建鲤肠道抗氧化能力的影响及其作用机制研究，硕士学位论文，共55页。
摘要： 鱼类肠道是营养物质消化吸收的重要器官,但易引起氧化损伤破坏其结构,导致功能异常。肌醇是水生动物饲粮中必需添加的营养物质,化学研究表明肌醇含有抗氧化的分子结构,然而关于肌醇对动物抗氧化能力的影响未见研究报道。因此,本论文首先通过体内和体外试验系统考察肌醇对幼建鲤(Cyprinus carpio var. Jian)肠道酶性抗氧化能力和非酶性抗氧化能力的影响及其影响幼建鲤肠上皮细胞抗氧化能力的作用方式。其中,CuZnSOD在抗氧化中起重要作用,核因子相关因子2(NF-E2-related factor2, Nrf2)则是调控哺乳动物抗氧化酶基因表达的关键转录因子。因此,本论文将在克隆鱼肠CuZnSOD基因启动子、Nrf2、PKCδ、Keap1和MafG等基因序列的基础上,首次研究鱼肠CuZnSOD基因启动子是否含有抗氧化反应元件(ARE)及Nrf2、PKCδ、Keap1和MafG是否在鱼肠表达；并率先研究肌醇是否通过影响Nrf2核转位、MafG基因和蛋白表达及Nrf2结合ARE来影响抗氧化酶基因转录；进一步探明肌醇通过影响Nrf2基因和蛋白表达、Nrf2和PKC磷酸化、Keap1基因表达调控Nrf2核转位的机制；揭示肌醇影响幼建鲤肠道抗氧化能力的作用机制。本研究共包括以下5部分试验： 1.肌醇对幼建鲤肠道抗氧化能力和抗氧化酶基因表达的影响 本试验选择22.28±0.07克的健康建鲤1050尾,随机分为7个处理,每个处理3个重复,每个重复50尾鱼,各处理分别饲喂含不同水平肌醇(163.5、232.7、384.2、535.8、687.3、838.8和990.3mg/kg)的日粮60天。结果表明：幼建鲤肠道丙二醛和蛋白质羰基含量随着肌醇添加的提高而显著降低(P0.05),当肌醇分别添加到535.8和838.8mg/kg时达到平台值(P0.05)；肌醇显著提高了幼建鲤肠道的ASA、AHR和SOD活力(P0.05)；CAT活力随着肌醇添加水平的提高而显著提高(P0.05),当添加到535.8mg/kg时达到平台值(P0.05);当添加≥687.3mg/kg肌醇时,肠道GPx、GST和GR活力显著高于其余各组(P0.05);非酶抗氧化GSH含量随着肌醇添加水平的提高显著提高(P0.05),当肌醇添加到384.2mg/kg时达到平台值(P0.05)；肌醇显著提高了幼建鲤前肠CuZnSOD、MnSOD、CAT和GPx1b基因表达量(P0.05)；显著提高了中肠CuZnSOD、CAT、GPxla和GPxlb基因表达量(P0.05)；显著降低了中肠MnSOD及前、中、后肠GR的基因表达量(P0.05)；肌醇对幼建鲤后肠CuZnSOD、MnSOD、CAT、GPxla和GPx1b基因表达量没有显著影响(P0.05)。结果说明：肌醇增加了肠道的抗脂质过氧化和抗蛋白质氧化的能力、提高了酶性抗氧化和非酶性抗氧化能力,酶性抗氧化能力的提高与肌醇提高前肠和中肠的CuZnSOD、CAT和GPxlb及中肠GPxla的基因表达有关。 2.肌醇对鱼肠上皮细胞结构完整性的影响及其作用方式研究 2.1肌醇对鲤鱼肠上皮细胞结构完整性的影响 本试验通过研究肌醇对贴壁培养的鲤鱼肠上皮细胞(IECs)增殖、分化、功能、抗氧化能力和抗氧化损伤的影响来探索肌醇对鱼类肠上皮细胞结构完整性的影响。IECs细胞分别用0、15、30、45、60和75mg/L肌醇处理96小时。结果表明：适量肌醇显著促进了IECs的成活；提高了AKP、γ-GT、Na+,K+-ATPase、CK、T-SOD、 CuZnSOD、MnSOD、CAT、GPx和GST活力(P0.05)；肌醇显著降低了幼建鲤IECs的脂质过氧化MDA和蛋白质氧化PC(P0.05)；相关分析表明：细胞活性MTT和抗氧化酶活力呈显著的正相关(P0.05),和LDH、MDA和PC呈显著的负相关(P0.05)。结果表明：肌醇可通过提高IECs抗氧化能力来提高抗脂质过氧化和抗蛋白质氧化的能力,从而维持IECs的结构完整性和功能正常。 2.2铜诱导IECs氧化应激模型 本试验研究了0-6.0mg/L铜对幼建鲤IECs氧化损伤指标和酶性抗氧化指标的影响。结果表明：培养液的LDH和MDA随着铜应激剂量的增加而显著增加(P0.05),到2.4mg/L时MDA达到平台值；铜应激降低了细胞活性MTTOD、细胞蛋白含量、AKP、T-SOD和CuZnSOD活力(P0.05)；提高了CAT和GPx活力(P0.05)；2.4-6.0mg/L铜可诱导鲤鱼肠上皮细胞的氧化应激。结果说明：铜应激引起鲤鱼肠上皮细胞酶性抗氧化系统失衡、降低了细胞增殖分化能力、导致了脂质过氧化损伤,破坏了细胞的结构完整性；本试验以LDH和MDA指标确定铜诱导IECs的应激剂量为6mg/L。 2.3应激前添加肌醇对IECs的保护作用 本试验通过应激前添加0-75mg/L的肌醇处理IECs72小时,再用[2.2]建立的应激剂量6mg/L铜处理IECs24小时,考察肌醇对鱼类IECs的保护作用。结果表明：铜应激诱导了IECs的LDH的释放和细胞脂质过氧化(P0.05),而应激前添加15-75mg/L可有效的保护细胞不受铜诱导的氧化损伤(P0.05)；应激前添加肌醇降低了铜应激引起的蛋白质氧化(P0.05)；同时防止了铜应激导致的AKP、ASA、AHR、T-SOD和CuZnSOD活力下降(P0.05)；然而,铜应激引起了CAT活力的适应性增加,而应激前添加肌醇维持了CAT的正常水平；铜应激引起了GPx和GST活力的适应性增加(P0.05),而应激前添加肌醇进一步提高了GPx和GST活力(P0.05)；应激前添加肌醇防止了铜应激引起的GR活力和GSH含量的降低(P0.05)。结果说明：应激前添加肌醇可通过提高鲤鱼肠上皮细胞的酶性抗氧化能力和非酶性抗氧化能力来保护IECs不受铜应激引起的氧化损伤,保护了细胞的完整性。 2.4应激同时添加肌醇阻截铜诱导IECs的氧化损伤 本试验通过应激同时添加不同浓度的肌醇(0-75mg/L)和6mg/L铜处理鲤鱼IECs24小时,考察肌醇对铜诱导IECs氧化损伤的阻截作用。结果表明：铜应檄组显著增加了培养液中LDH、MDA和细胞PC含量(P0.05),应激同时添加肌醇可逐渐降低铜诱导的LDH释放(P0.05),并完全抑制了铜诱导的蛋白质氧化(P0.05),但是对铜诱导的脂质过氧化没有影响；应激同时添加肌醇阻截了铜应激诱导的抗氧化系统失衡,具体体现在阻截铜应激诱导的T-SOD、CuZnSOD和CAT活力降低；抑制铜应激引起的AHR、GPx、GST和GR活力适应性升高(P0.05)。结果说明：应激同时添加肌醇可阻截铜应激引起的IECs酶性抗氧化系统失衡,降低了IECs的蛋白质氧化,但对铜应激引起的脂质过氧化没有影响。 2.5应激后添加肌醇修复IECs的氧化损伤部位 本试验通过用6mg/L铜处理IECs24小时,随后添加0-75mg/L的肌醇处理IECs72小时,考察肌醇对IECs氧化损伤的修复作用。结果表明：铜应激引起的IECs脂质过氧化和蛋白质氧化均能被肌醇修复(P0.05)；应激后添加肌醇使铜应激诱导的AKP、ASA、T-SOD和CuZnSOD活力降低回复到正常水平(P0.05)；铜应激引起的CAT活力降低被肌醇部分修复(P0.05)；然而,铜应激引起了GPx活力和GSH含量适应性升高(P0.05),应激后添加肌醇能缓解铜应激引起的细胞GPx活力和GSH含量的升高(P0.05)。结果说明：应激后添加肌醇通过提高IECs的T-SOD、CuZnSOD和CAT活力来修复了脂质过氧化损伤和蛋白质氧化损伤。 3. CuZnSOD基因启动子、Nrf2等基因克隆和肠道组织中的表达规律研究 本试验利用分子生物技术克隆了鲤鱼CuZnSOD基因启动子、Nrf2和PKCδcDNA全序列及Keap1和MafG等基因,并研究了其在鱼肠道的表达规律。结果表明：鲤鱼CuZnSOD基因启动子为1675bp,含有1个抗氧化反应元件ARE；Nrf2和PKCδ cDNA全序列分别为2557bp和2862bp,开放阅读框分别为1761bp和2061bp,分别编码586个和686个氨基酸残基,蛋白质分子量分别为66071.7Da和78498.36Da,等电点分别为4.49和7.53；Keap1a、Keap1b、MafG1和MafG2部分cDNA分别为843、521、394和344bp,分别编码240、173、130和114个氨基酸残基；Nrf2、PKCδ、Keap1a、Keap1b、MafG1和MafG2在鲤鱼肠道均有表达,分别在第]、4、6、2、6和6肠段表达量最高。结果说明：鲤鱼CuZnSOD基因启动子含有ARE,鱼肠道表达Nrf2/ARE信号途径中重要的基因PKCδ、Keap1a、 Keap1b、MafG1和MafG2,本试验结果为进一步探索肌醇影响鱼肠道CuZnSOD基因转录的机制奠定了基础。 4.肌醇对幼建鲤肠道Nrf2核转位的影响及其作用方式研究 本试验选择健康建鲤300尾,随机分为2个处理,每个处理3个重复,每个重复50尾鱼,各处理分别饲喂不添加和添加肌醇的半纯合试验日粮60天。通过观测幼建鲤前、中和后肠细胞核Nrf2的量、MafG基因和蛋白表达量、Nrf2结合ARE的量来探索肌醇对幼建鲤前、中、后肠Nrf2核转位及通过ARE调控CuZnSOD基因转录的可能作用方式。结果表明：肌醇显著提高了幼建鲤前肠和中肠细胞核Nrf2的量、MafG的基因和蛋白表达量以及细胞核中Nrf2结合ARE (CuZnSOD)的量(P0.05)；而肌醇对幼建鲤后肠Nrf2核转位、MafG基因和蛋白表达、Nrf2结合ARE的量均无显著影响(P0.05)。结果说明：肌醇可促进幼建鲤前肠和中肠Nrf2核转位及核转位后结合ARE激活CuZnSOD基因的转录,但是肌醇不能通过促进后肠Nrf2核转位来调控CuZnSOD基因转录。 5.肌醇影响幼建鲤肠道Nrf2核转位的作用机制研究 本试验的试验设计同实验四。结果表明：肌醇提高了幼建鲤前肠Nrf2基因和总蛋白含量、Nrf2和PKCδ磷酸化(P0.05),但对锚定蛋白Keap1a和b的基因表达没有影响(P0.05)；肌醇提高了幼建鲤中肠Nrf2基因和总蛋白含量、Nrf2和PKCδ磷酸化水平和Keap1a、b的基因表达量(P0.05);肌醇对幼建鲤后肠Nrf2基因和总蛋白含量、Nrf2和PKCδ磷酸化水平没有影响,但降低了Keap1a和Keap1b的基因表达量(P0.05)。结果说明：肌醇通过上调幼建鲤前肠Nrf2基因和总蛋白水平、Nrf2和PKCδ磷酸化水平来促进Nrf2核转位；肌醇通过上调幼建鲤中肠Nrf2基因和总蛋白水平、Nrf2和PKCδ磷酸化水平促进Nrf2核转位,但是上调了锚定蛋白Keap1a/b的表达,启动了Nrf2核转位的抑制；肌醇下调了后肠锚定蛋白Keap1a/b的表达,开始启动上调Nrf2的核转位。 综合试验结果说明：肌醇提高了幼建鲤肠道抗脂质过氧化和抗蛋白质氧化的能力,这与其提高了酶性抗氧化能力和非酶性抗氧化能力有关,肌醇提高酶性抗氧化能力与其提高了幼建鲤前肠和中肠CuZnSOD,CAT及GPx1b的基因表达量有关；肌醇可通过保护、阻截和修复的作用方式增强幼建鲤肠上皮细胞(IECs)抗脂质过氧化和抗蛋白质氧化的能力,进而维持了IECs的结构完整性和功能正常；鲤鱼肠道CuZnSOD基因启动子上有抗氧化反应元件(ARE),并且信号分子Nrf2、MafG、PKCδ及Keap1等均在肠道表达；肌醇提高幼建鲤前肠和中肠CuZnSOD基因表达与其促进了Nrf2核转位及Nrf2核转位后与ARE的结合有关；肌醇通过提高前肠和中肠Nrf2的基因和总蛋白水平、Nrf2和PKCδ磷酸化来促进Nrf2的核转位；肌醇降低了后肠锚定蛋白Keap1a/b的基因表达量,开始启动上调Nrf2的核转位。
关键词:肌醇;核因子相关因子2;铜锌超氧化物歧化酶;鱼肠上皮细胞;抗氧化

第一章绪论
1前言
肠道是鱼类营养物质消化吸收的主要场所,也是點膜免疫的重要屏障;肠上皮细胞(Intestinal Epithelial Cells, lECs)是营养物质消化吸收和免疫防御的主要功能性细胞II】。因此,]ECs增殖分化和结构完整是保证肠道功能的重要基础,也是提高水生动物健康和生产力的关键。研究发现:维生素B6 (Vitamin B6, VBe)可通过提高鱼类肠道抗氧化能力来维持肠道结构完整性、提高消化吸收能力,促进鱼类生长肌醇(Afyo-inositol,MI)是B族维生素,陆生动物自身可以大量合成肌醇满足其需要,但是鱼类自身几乎不能合成肌醇,因此肌醇是鱼类必需的营养物质I4]。饲料中不添加肌醇会引起普通鲤鱼生长严重受阻、皮肤糜烂和死亡率高15]。本试验的前期研究发现:肌醇缺乏降低了鱼类消化和吸收能力、疾病抵抗力和免疫力,从而导致其生长性能下降和死亡率增加16]。报道:消化吸收能力、疾病抵抗力下降与肠道氧化损伤和机体氧化损伤有关。通过化学方法研究表明:肌醇的多元醇结构可给出氢(H、e-)传递给自由基,可能直接清除自由基起抗氧化作用18]。肌醇是否对动物有抗氧化作用未见研究报道。因此, 展肌醇对鱼类抗氧化能力的影响的研究十分必要。
鱼类的抗氧化能力由抗氧化酶和非酶抗氧化物质组成I9]。抗氧化酶活力受其基因转录水平的影响_。近年的研究表明:核因子相关因子2 (NF-E2-related factor 2,Nrf2)是调控人和歐抗氧化酶基因转录的关键转录因子1"】。在正常情况下,人和鼠Nrfi被Kelch 样 ECH 联合蛋白 1 (Kekh-like ECH-associated protein 1, Keapl)蛋白描定在细胞质中,不能进入细胞核调控祀基因的转录,在抗氧化剂tBHQ作用下,蛋白激酶Cdelta (Protein kinase C delta, PKC5) 酸化 Nrf2,使其从 Keapl 上解离,并转入细胞核中(核转位)与原癌基因sMaf (small Maf, sMaf)蛋白结合,进而识别、结合基因启动子上的抗氧化反应元件(Antioxidant respone element,ARE)调控下游基因转录然而,关于鱼类肠道是否表达Nrf2、PKC5、Keapl和sMaf等基因,以及肌醇是否通过影响这些信号分子来影响了鱼类肠道的抗氧化酶基因转录未见研究报道,开展相关研究非常必要。
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