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硕士论文-苦瓜亲缘关系和Mp-21.6蛋白的分离及生物活性研究，共78页，46922字
摘 要
苦瓜（Momordica charantia L.）系葫芦科草本植物，富含多种营养成分，作为一种
传统的蔬菜和中药，具有药膳同源之功效。更重要的是存在多样的、具药理生物活性的
蛋白质，具有抗肿瘤、抗病毒、抗生育等多方面的保健作用。本试验以油苦瓜串为试验
材料，采用硫酸铵分级制备苦瓜果实蛋白并进行抑菌试验；经过 DEAE-52 阴离子层析、
Sephadex G-100 凝胶柱层析进一步分离纯化苦瓜蛋白；同时试验检测分离纯化苦瓜蛋白
对细菌和真菌的抑制活性及稳定性和最低抑菌浓度(MIC)；运用生化-分子生物学技术研
究分离纯化苦瓜蛋白的生物学特性及抗氧化性；以六种葫芦科植物为材料，应用分子标
记技术鉴定和分析苦瓜种质资源及亲缘关系。主要试验结果有：
⒈ SDS-PAGE 电泳分级制备苦瓜蛋白图谱显示：不同硫酸铵饱和度沉淀的苦瓜蛋
白不同：30%硫酸铵沉淀蛋白主要含有分子量约为 30KD，22KD，14.5KD 的蛋白；
30%-60%硫酸铵沉淀蛋白主要含有分子量约为 56KD，45KD，32KD 的蛋白；60%-90%
硫酸铵沉淀蛋白主要有分子量约为 43KD，32KD，30KD 的蛋白，三种硫酸铵分级制备
苦瓜蛋白均含有分子量小于 14.4KD 的小分子蛋白。体外抑菌试验表明：30%的硫酸铵
沉淀蛋白对供试细菌和真菌具有抑菌活性，60%-90%硫酸铵沉淀蛋白抑菌效果不明显。
⒉ DEAE-52 阴离子层析 30%硫酸铵沉淀蛋白，共得到一个穿透峰（P）和两个吸
收峰（E1、E2），抑菌试验显示穿透峰 P 具有抑菌活性，其蛋白的 PI＞8.0；SDS-PAGE
显示 P 含有两种蛋白，一分子量约为 22KD，另一组分是分子量小于 14.4KD 的小分子
蛋白；活性峰 P 蛋白进一步 Sephadex G-100 凝胶柱纯化后，共得到两个吸收峰。体外抑
菌试验显示峰 1（I1）具有抑菌活性，SDS-PAGE 电泳显示为单一蛋白组分。
⒊ 纯化苦瓜蛋白的抑菌试验表明，纯化苦瓜蛋白对试验细菌和真菌具有显著的抑
制作用；对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的 MIC 低于 0.1mg/mL；对酵母菌的 MIC 低于
0.4mg/mL；对黄曲霉的 MIC 低于 1.6mg/mL。而且纯化苦瓜蛋白的抑菌活性具有较好的
稳定性，对紫外光照射稳定，低温贮藏时间对其活性影响较小，在偏酸和中性及低于
0.8mg/mL 的 NaCL 条件下抑菌效果较好，但其热稳定性稍差。
⒋ 纯化苦瓜蛋白分子的生化特性试验表明，纯化苦瓜蛋白的氨基酸组成为：赖氨
酸：7.68%；含硫氨基酸：6.69%；必需氨基酸：55.21%；非极性氨基酸：32.47%；极
性氨基酸：16.12%；带正电氨基酸：27.07%；带负电氨基酸：22.36%。纯化苦瓜蛋白等
电点为 9.6，存在链内二硫健，无链间二硫健，其分子量为 21.6KD 遂命名为 Mp-21.6。
⒌ Mp-21.6 苦瓜蛋白的抗氧化性试验表明，Mp-21.6 除具有显著的广谱抗菌作用外，
还具有明显的抗氧化能力。Mp-21.6 在不同的抗氧化体系中抗氧化能力不同，其清除羟
自由基、总抗氧能力率只略低于相同浓度下的抗坏血酸组分，且作用效应与浓度成量效
关系。
⒍ RAPD 扩增及遗传多样性与聚类分析表明：苦瓜与丝瓜、黄瓜、茭瓜、南瓜和
佛手瓜的遗传距离指数分别为 0.4393、0.4583、0.6000、0.5735 和 0.7306。苦瓜与丝瓜
亲缘关系最近，其次依次为黄瓜、南瓜和茭瓜，与佛手瓜最远。
本研究探索了苦瓜种质资源及亲缘关系，分离纯化苦瓜活性蛋白，筛选出具有生物
活性的有效成分 Mp-21.6 苦瓜蛋白，并检测分析了 Mp-21.6 蛋白的生物学特性，为分离
纯化特定生物活性有效蛋白和临床应用建立了牢固的理论与技术基础，在新药的研制与
开发中具有重要的科学意义和经济价值。
关键词：Mp-21.6 苦瓜蛋白；分离纯化；柱层析；抑菌活性；抗氧化作用；RAPD；
目录
中文摘要……1
英文摘要……3
缩写词及英汉对照………………....5
文献综述…....6
1 前言.... .... ..6
1.1 苦瓜的本草学考证… ………....6
1.2 苦瓜的药理成分…………….. ..7
1.3 苦瓜药用成分的生理功能及作用机理 ……………...10
1.4 苦瓜功能性食品的开发及潜势.17
1.5 研究的目的和内容………. ….. 19
试验内容…...20
1 苦瓜蛋白的分级制备与抑菌试验20
1.1 引言……..20
1.2 材料与方法…………………….20
1.2.1 试验材料………………….….20
1.2.2 试验方法..…….. …….. ……..21
1.3 结果与分析…………………….23
1.3.1 分级制备苦瓜蛋白的电泳图谱………………. ……23
1.3.2 分级制备苦瓜蛋白的抑菌试验……………………..24
1.4 讨论….. ..25
2 苦瓜蛋白的分离纯化与抑菌作用27
2.1 引言…….27
2.2 材料与方法………………….. .27
2.2.1 试验材料…………………….27
2.2.2 试验方法…………………….28
2.3 结果与分析…………………….31
2.3.1 苦瓜抑菌蛋白的纯化……………….. ……….. ……31
2.3.2 纯化苦瓜蛋白的抑菌试验…………………….. … ..33
2.3.3 纯化苦瓜蛋白的稳定性试验..34
2.3.4 纯化苦瓜蛋白最低抑菌浓度的测定………………..39
2.4 讨论……40
3 纯化苦瓜蛋白的生化特性研究…42
3.1 引言….. .42
3.2 材料与方法……………………42
3.2.1 试验材料……………………42
3.2.2 试验方法……………………43
3.3 结果与分析……………………45
3.3.1 纯化苦瓜蛋白氨基酸成分的测定………………….45
3.3.2 纯化苦瓜蛋白分子量的测定.46
3.3.3 纯化苦瓜蛋白等电点的测定.47
3.3.4 纯化苦瓜蛋白二硫健的分析…………………… …48
3.4 讨论……48
4 苦瓜蛋白 Mp-21.6 的抗氧化作用.49
4.1 引言……50
4.2 材料与方法……………………50
4.2.1 试验材料……………………50
4.2.2 试验方法……………………50
4.3 结果与分析……………………52
4.3.1 Mp-21.6 清除羟自由基能力测定…………………. 52
4.3.2 Mp-21.6 总抗氧化能力测定. 53
4.4 讨论……54
5 苦瓜亲缘关系的 RAPD 分析…... ...55
5.1 引言……………………... ……..55
5.2 材料与方法 ………………….. .55
5.2.1 试验材料……………………..55
5.2.2 试验方法……………………..56
5.3 结果与分析…………………….. 58
5.3.1 基因组 DNA 提取方法的比较优选…………………. 58
5.3.2 引物的筛选………………….. ….. ……….. ….. …..60
5.3.3筛选引物的 RAPD 扩增……....60
5.3.4 遗传多样性与聚类分析……....62
5.4 讨论……...64
结论………....66
参考文献….. .67
致 谢…….….72