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硕士论文-枯草芽孢杆菌XM16菌株抗真菌蛋白的分离纯化及性质结构研究，共71页，39613字
摘 要
本文研究了枯草芽孢杆菌菌株 XM16 产生抗菌蛋白的发酵条件，从其发酵液中分离纯化出
了抗菌蛋白，并对抗菌蛋白的性质和结构进行了初步的探讨，对抗菌蛋白的应用打下了良好
的基础。
采用不同的温度、不同的发酵时间、不同的摇床转速、不同的培养基以及培养基的不同
pH 值对拮抗菌株 XM16 进行培养发酵，检测其发酵液的抗菌活性，得到了产生抗菌蛋白的最
佳条件：在 pH 值 7 的 BYP 培养基中，以 30℃的温度，摇床转速为 200r/m 震荡培养 48h，以
30%和 70%饱和度的硫酸铵进行分级盐析，可得到大量的抗菌蛋白。
采用上述的培养条件，通过硫酸铵分级沉淀，经过透析除盐，浓缩蛋白粗提液经过
Sephacryl S-100HR 凝胶柱层析分离纯化到一种对棉花枯萎病菌具有抑制用的蛋白质，凝胶
层析的峰Ⅰ和峰Ⅱ都有抑菌活性，说明此拮抗菌株不止分泌一种抗菌蛋白，通过 SDS-PAGE 聚
丙烯酰胺凝胶电泳可以看出含有两种蛋白。
通过对抗菌蛋白进行温度、pH、蛋白酶、氯仿的敏感性测定，发现该抗菌蛋白对热稳定
性较好，经过 100℃热处理 30min，活性未丧失；该抗菌蛋白在不同的酸碱情况下比较稳定，
但在强碱条件下活性会下降；经氯仿处理后的抗菌蛋白溶液，仍具有明显的抗菌活性，说明
其对氯仿不敏感；在各种蛋白酶处理下，发现用蛋白酶 E 处理过的蛋白质溶液丧失抑菌活性，
但蛋白酶 K 和胰蛋白酶处理过的仍具有部分活性。
通过研究发现该抗菌蛋白含有两种蛋白，其分子量分别为 21KD 和 30KD，这两种抗菌蛋
白的质谱分析表明：分子量为 21KD 的蛋白共含有 19 种氨基酸，其中亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)、
甘氨酸(G)3 种氨基酸的含量最高，而异亮氨酸(I)和色氨酸(W)的含量最少，蛋白中不含半胱
氨酸(C)，并且查明该蛋白是一种新的功能蛋白；而分子量为 30KD 的蛋白也含有 19 种氨基酸，
其中苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)、甘氨酸(G)的含量最高，而蛋氨酸(M)和组氨酸(H)的含量最低，
蛋白中也不含半胱氨酸(C)，并且查明该蛋白是与一种已知蛋白具有同源性的功能蛋白。
关键词： 抗菌蛋白
分离纯化
性质
结构
目录
中文摘要…………….…..…....Ⅰ
英文摘要.…………..….…..….Ⅱ
前言…..…...1
1 芽孢杆菌属的研究现状…….1
1.1 芽孢杆菌属及其在植物病害防治中的应用……………….……….1
1.2 产生拮抗物质的芽孢杆菌的种类及特性………………….……….4
1.3 芽孢杆菌属产生拮抗物质的种类…….……….5
1.4 芽孢杆菌生防作用的分子机制………………..7
1.5 芽孢杆菌抗菌物质的作用机制……………....10
1.6 芽孢杆菌抗菌蛋白的分离提取………...…….11
2 本研究的目的和意义……...12
材料与方法……………….…..14
1 试材……...…………………15
2 方法...…16
2.1 XM16 菌株发酵及其产生抗菌蛋白条件的研究……………….…16
2.1.1 拮抗活性测定方法及指示菌的确定………..16
2.1.2 发酵培养基的确定…….16
2.1.3 拮抗物质的粗提取和抗菌活性物质的确定………………….....16
2.1.4 最佳硫酸铵饱和度的确定………………….16
2.1.5 发酵时间对产生抗菌蛋白的影响………….17
2.1.6 发酵温度对产生抗菌蛋白的影响………….17
2.1.7 摇床转速对产生抗菌蛋白的影响………….17
2.1.8 培养基 pH 值对产生抗菌蛋白的影响…..…17
2.2 XM16 抗菌蛋白的分离纯化…………….…….17
2.2.1 菌株的发酵和抗菌蛋白的粗提取……….…17
2.2.2 抑菌活性测定方法………………….. ……..17
2.2.3 抗菌蛋白的纯化.. ……..17
2.2.3.1 Sephacry1 S-100HR 凝胶柱层析…. ………17
2.2.3.2 蛋白质纯度鉴定……..18
2.3 XM16 抗菌蛋白的主要性质及结构测定……..19
2.3.1 抗菌蛋白分子量的测定.19
2.3.2 抗菌蛋白在水、有机溶剂中的溶解性测定.19
2.3.3 抗菌蛋白对氯仿的稳定性测定…………….19
2.3.4 抗菌蛋白对酸碱的稳定性测定………….....19
2.3.5 抗菌蛋白对温度的敏感性测定………….....19
2.3.6 抗菌蛋白的茚三酮反应.20
2.3.7 抗菌蛋白对蛋白酶的敏感性测定……….....20
2.3.8 抗菌蛋白对几种病原菌的拮抗作用…….....20
2.3.9 抗菌蛋白的质谱鉴定分析………………….20
结果与分析…………………...21
1 XM16 菌株发酵及其产生抗菌蛋白条件的研究.21
1.1 拮抗活性测定方法及指示菌的确定….………21
1.2 发酵培养基的确定.………21
1.3 拮抗物质的粗提取和抗菌活性物质的确定….21
1.4 最佳硫酸铵饱和度的确定.22
1.5 发酵时间对产生抗菌蛋白的影响………..…...22
1.6 发酵温度对产生抗菌蛋白的影响……….…....23
1.7 摇床转速对产生抗菌蛋白的影响………….…23
1.8 培养基 pH 值对产生抗菌蛋白的影响………...24
2 XM16 抗菌蛋白的分离纯化.24
2.1 粗蛋白的抑菌活性………24
2.2 Sephacry1 S-100HR 凝胶柱层析结果…….…..24
2.3 蛋白质纯度鉴定………….25
3 XM16 抗菌蛋白的主要性质及结构测定……….26
3.1 抗菌蛋白分子量………....26
3.2 抗菌蛋白在水、有机溶剂中的溶解性测定….26
3.3 抗菌蛋白对氯仿的稳定性测定………………26
3.4 抗菌蛋白对酸碱的稳定性测定………………26
3.5 抗菌蛋白对温度的敏感性测定……………....27
3.6 抗菌蛋白的茚三酮反应…27
3.7 抗菌蛋白对蛋白酶的敏感性测定………...….27
3.8 抗菌蛋白对几种病原菌的拮抗作用….……...28
3.9 抗菌蛋白的质谱分析结果………….………...30
3.9.1 分子量为 21KD 的蛋白的质谱分析结果….30
3.9.2 分子量为 30KD 的蛋白的质谱分析结果…..32
讨论……...36
1 拮抗菌株的发酵……….…..36
2 抗菌蛋白的分离纯化……...36
3 SDS-PAGE 电泳技术测定蛋白质分子量……….36
4 抗菌蛋白的质谱分析……...37
5 抗菌蛋白对几种病原菌的拮抗作用…………...37
6 应用前景…………………...38
结论……...39
参考文献...40
附录……...48
致谢……...58
导师组意见