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硕士论文-农杆菌介导LEA基因转化大豆的初步研究，共64页，41138字
摘要
LEA(late embryogenesis abundant) 蛋白是在植物发育晚期种子大量积累的一类蛋白
质。此外，在受干旱、盐、低温胁迫的植物营养组织中，这种蛋白质也可被诱导表达。
因此，LEA 蛋白是与植物细胞抗逆保护作用密切相关的蛋白。在植物转基因的这一领域，
大豆是较难转化的作物之一，这是由于大豆组织培养再生困难，可重复性差，基因型之
间差异大，遗传转化体系是完全根据大豆的基因型所建立的。本试验通过大豆子叶节器
官发生途径的再生系统，选用我国栽培大豆再生频率高的 3 个基因型，并对影响再生频
率和农杆菌介导的遗传转化系统的主要因素进行了优化，建立了一个适于农杆菌转化的
大豆子叶节高效受体系统，并在此基础上进行了 LEA 基因的初步遗传转化研究。
首先用 EcoRⅠ和 HindⅢ双酶切将 pROKⅡ-LEA 质粒上的 P35S-LEA-Tnos 完整表达框
切下，并插入到具有相同酶切位点的 pCAMBIA1301 植物表达载体上，构建了 pCAM-LEA
植物表达载体。该载体上除了目的基因外，还具有潮霉素抗性基因和 GUS 报告基因。
为了建立有效的潮霉素筛选体系，将农杆菌浸染的半片种子在共培养基上共培养 3~5
d 后，在无筛选剂的培养基上恢复培养 7 d，然后放在含有不同浓度潮霉素的筛选培养基
上进行筛选。实验结果表明，最适潮霉素浓度为 10 mg/L。
研究了不同浓度的羧苄青霉素和头孢霉素对不定芽分化的影响，结果表明在 0~300
mg/L 之间对大豆子叶节的生长以及不定芽的分化无较大的影响，在外植体与农杆菌共培
养后，添加 250 mg/L 的羧苄青霉素和头孢霉素可有效抑制农杆菌的生长，一般 8 d 更换
一次培养基。
农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化中，对共培养后的大豆子叶节组织进行了 GUS 瞬
时表达检测，根据 GUS 瞬时表达率的高低，决定侵染和共培养的最适时间分别为 30min
和 3d。
采用 PCR 方法和 GUS 组织化学方法对转基因的植株进行了鉴定，结果表明，在合
丰 25 和吉林小豆两个品种中分别获得转基因植株 6 株和 3 株 ，转化效率分别为 0.86%
和 1.25%。
关键词：大豆;LEA；子叶节；GUS；遗传转化
目 录
中文摘要 …
英文摘要 …
中英文缩略词………………………
1 文 献综述 ……………
1.1 大豆转基因的方法
1.2 大豆遗传转化的基因种类…………………
1.3 转基因植株的筛选与检测…………………
1.4 转基因植株的安全性问题和商业前景……
1.5 LEA 蛋白研究进展
1.6 农杆菌介导大豆遗传转化的主要障碍……
1.7 本研究的目的和意义………………………
2 pCAM-LEA 植物表达载体的构建…………
2.1 试验材料………
2.2 试验方法….…
2.3 结果与分析………
2.4 载体构建的意义…
3 农杆菌介导的大豆遗传转化………………..
3.1 试验材料……………….……………………
3.试验方法…………………….………………..................…………
3.3 结果与分析……..…
4 转基因大豆的检测…
4.1 主要试剂……………………...……………………
4.2 试验方法………..………
4.3 结果与分析………
5 讨论……...
5.1 大豆子叶节器官发生途径的基因型筛选…
5.2 农杆菌介导大豆遗传转化系统…………
5.3 转 LEA 基因大豆中存在转录后基因沉默的可能性分析……………
6 结论和后续工作展望……………………...
参考文献 ………………… ………………
致谢…………………...
附录………………