芹菜甲素对D-半乳糖衰老模型小鼠的作用
摘要 目的 研究芹菜甲素对D-半乳糖所致小鼠学习记忆能力下降和各项衰老指标的对抗作用，以期探讨芹菜甲素的抗衰老作用机制。方法 以D-半乳糖衰老模型小鼠为实验对象，以其体重、免疫器官重量，肝脑丙二醛（MDA）和脂褐素(LF)的含量，全血谷胱苷肽过氧化氢酶(GSH-PX)、红细胞过氧化氢酶(CAT)和脑中超氧化物歧化酶(SOD)的活力为指标，全面考察芹菜甲素的抗衰老作用。结果 芹菜甲素(20，40mg.kg-1,ig),能对抗连续6周给D-半乳糖（5%，0.25ml.（10g）-1）所致小鼠脑组织中LPO、LF含量的升高，提高全血GSH-PX、、红细胞CAT和脑中SOD的活力，并对抗小鼠体重、脾脏及胸腺指数下降。 结论 芹菜甲素能有效地对抗D-半乳糖所致的小鼠多项衰老指标的出现，促进衰老小鼠的学习记忆能力。
关键词 芹菜甲素 D-半乳糖 衰老 小鼠
芹菜甲素（butyl-phthalide）是从伞形科植物芹菜中提取分离的有效成分，药理研究[1]表明，芹菜素有降压、镇静、抑菌等作用。但目前对其促智和抗衰老作用研究较少，本文采用D-半乳糖衰老模型小鼠考察了芹菜甲素的抗衰老和促智作用。
1 材料
1.1 动物 昆明种小鼠（合格证号：SCXK(鲁)20040013）♂，体质量18～22g，由山东大学实验动物中心提供。
1.2 药品与试剂 芹菜甲素：济宁医学院中药室提供，批号：060412。D-半乳糖：Sigma公司生产，上海生化试剂公司分装，批号：060824。羧甲基纤维素钠（CMC-Na）：天津市密欧化学试剂开发中心生产，批号20070113，用蒸馏水配成1%的溶液。.GSH-PX、CAT、SOD测定试剂盒均为南京建成生物工程研究所提供，批号：20070215。
1.3 仪器 WFZ800-D2型紫外可见分光光度计，北京第二光学仪器厂；HITACHI650-60型荧光分光光度计，日本； 721分光光度计，上海第三分析仪器厂.
2 方法
2.1 D-半乳糖衰老模型的建立[2] 皮下注射5%D-半乳糖,0.25ml.10g-1；正常组皮下注射等体积的生理盐水；每天一次，连续6周。
2.2 给药方法 取健康♂小鼠40只，随机分为正常组、模型组、给药组。各给药组灌胃给予芹菜甲素(50、100mg.kg-1);正常组和模型组ig等体积的1%CMC-Na；给药同时造模，最后一天灌胃和注射D-半乳糖2h后，进行学习记忆训练实验，次日测定记忆成绩。然后处死测定各项衰老指标。
2.3 D-半乳糖衰老模型小鼠学习记忆能力的测定（跳台法）[3] 将动物放入跳台箱内适应3min，然后立即通36V交流电。动物受到电击，其正常反应是跳回平台以躲避伤害性刺激，如此训练5min。 24h后重做测验，此即记忆保持测验。记录小鼠第一次跳下平台的潜伏期和5min内的错误次数。
2.4 D-半乳糖衰老模型小鼠脑组织MDA、LF含量测定[2] 小鼠断头处死，立即取脑，用硫代巴比妥酸（TBA）法测定组织丙二醛（MDA）的含量；用荧光法测定脑组织中LF的含量。
2.5 D-半乳糖衰老模型小鼠全血GSH-PX、红细胞CAT和脑中SOD活力的测定 小鼠末次给药后第二天眼眶取血，断头处死取全脑，分别按试剂盒说明测定GSH-PX、CAT和SOD
2.6 数据处理与统计学方法统计学方法
采用SPSS13.0统计软件包。实验数据均为三次实验的平均值，采用Univariate进行分析，各处理之间差异采用Duncan检验，以P＜0.05为显著性差异，P＜0.01表示极显著性差异。
各组数据采用 ±S表示，组间比较采用t检验。
3结果
3.1芹菜甲素对衰老模型小鼠学习记忆的影响 与正常对照组相比，模型组小鼠记忆明显衰退，表现为错误次数增加，潜伏期缩短（均P﹤0.01）。与模型组比较，芹菜甲素（50，100mg.kg-1）可使小鼠错误次数明显减少，潜伏期明显延长。（表2）
Tab 2芹菜甲素对衰老模型小鼠学习记忆的影响
The effect of Butyl-phthalide on the deficit of learning and memory induced by D-galactose on mice in step-down test ( ±S ,n=10)
组别 剂量/mg.kg-1 错误次数 潜伏期/s
空白组 - 0.75±0.23 200.5±42.4
模型组 - 3.02±0.91## 51.2±26.5##
芹菜甲素组 20
1.69±0.85** 100.7±62.4*
40 1.16±0.41** 125.6±55.8**
# #P﹤0.01，compared with normal group;* P﹤0.05, ** P﹤0.01,compared with model group
3.2芹菜甲素对D-半乳糖致小鼠衰老模型脑内LPO、LF、含量的影响 与正常组比较，衰老模型小鼠脑组织中LPO、LF、含量增高，而芹菜甲素（50，100mg.kg-1）可显著抑制LPO、LF含量的增高（表3）
Tab 3. 芹菜甲素对D-半乳糖致小鼠衰老模型脑内LPO、LF、含量的影响
Effect of Butyl-phthalide on the content of LPO and LF on D-galactose-induced seniled mice.( ±S, n=10)
组别 剂量 /mg.kg-1 MDA/nmol.mg-1 LF/u.g-1
空白组 - 40.2±11.1 4.0±0.5
模型组 - 80.2±15.7## 7.8±1.3##
芹菜甲素组 20 61.5±10.3* 6.2±0.4**
40 48.6±14.5** 5.1±0.5**
## P＜0.01 compared with control group; *P＜0.05, **P＜0.01 compared with D-galactose group.
3.3芹菜甲素对D-半乳糖致衰老模型小鼠全血GSH-PX、红细胞CAT和脑中SOD活力的影响 与正常组比较，衰老模型小鼠全血GSH-PX、红细胞CAT和脑中SOD活力明显降低，而芹菜甲素（50，100mg.kg-1）可显著抑制三种酶活力的降低（表4）
Tab 4. 芹菜甲素对D-半乳糖致衰老模型小鼠全血GSH-PX、红细胞CAT和脑中SOD活力的
影响
Effect of butyl-phthalide on the activity of SOD of brain, CAT of erythrocyte and GSH-PX of blood in D-galactose-induced seniled mice. ( ±S, n=10)
组别 剂量
/mg.kg-1 SOD
/Ku.kg-1 CAT
/u.g-1.Hb GSH-PX
/ku.L-1
空白组 - 9.8±1.0 65.5±10.0 32.5±5.2
模型组 - 5.0±0.7# 46.3±5.2# 14.1±4.0##
芹菜甲素组 20 6.3±1.2* 56.7±9.2* 24.2±2.9*
40 7.4±1.5* 60.1±5.3* 29.5±5.1*
## P＜0.01,# P＜0.05 compared with control group; *P＜0.05, compared with D-galactose group.
对小鼠免疫器官重量的影响
产物对小鼠免疫器官重量的影响见表3.6。结果显示，阴性对照组荷瘤小鼠的胸腺、脾脏萎缩，重量明显减轻。正常对照组与阴性对照组相比，胸腺指数达到显著差异（P＜0.05），脾指数达到极显著差异（P＜0.01）。酸解产物和酶解产物剂量为40mg/kg时，治疗组与阴性对照组之间无显著差异（P＞0.05）；当剂量达到80mg/kg时，酶解产物的胸腺指数和脾指数与阴性对照组之间呈现显著差异（P＜0.05）；而当剂量增加到160mg/kg时，酸解产物的胸腺指数和脾指数与阴性对照组之间也达到显著差异（P＜0.05），酶解产物与阴性对照组之间为极显著差异（P＜0.01），且酶解产物的效果优于酸解产物。
4 讨论
D-半乳糖亚急性衰老模型是利用给小鼠连续皮下注射大剂量D-半乳糖,造成动物糖代谢紊乱而建立的。用D-半乳糖连续注射，小鼠可产生多项生化指标的变化，如脑组织MDA、LF含量的升高；脑中SOD、血中GSH-PX、红细胞中CAT活力的降低，这些变化和自然衰老的变化相一致，说明D-半乳糖可引起细胞和机体的衰老[4]。SOD、GSH-PX、CAT活性间接反映机体清除氧自由基的能力；而MDA、LF水平高低间接反映细胞受自由基攻击的严重程度。
本研究表明：芹菜甲素可以有效对抗D-半乳糖所致的小鼠亚急性衰老和学习记忆能力的降低，具有抗衰老作用。其抗衰老的机制可能是通过提高机体SOD、GSH-PX、CAT等抗氧化酶活力，从而对抗自由基对细胞的损伤，降低LPO、LF等代谢产物的产生而有效的对抗D-半乳糖所致的小鼠衰老体征的出现和学习记忆能力的下降。
参考文献
[1]．王本祥。现代中药药理学[M]. 天津科学技术出版社，第一版，1997；1127-1129
[2]．陈奇. 中药药理研究方法学[M].北京，人民卫生出版社，1994：895-939
[3]．徐淑云，卞如濂，陈修.药理实验方法学[M]. 北京，人民卫生出版社，第3版，2002：826-827
[4]．李文斌，韦丰，范明，等.半乳糖在小鼠上诱导的拟脑老化效应[J]. 中国药理学与毒理学杂志，1995，9（2）：93-95
Anti-aging action of Butyl-phthalide on D-galactose model mice
(自己填写)
ABSTRACT OBJECTIVE By using the D-galactose-induced aging mice,the effects and mechanism of Butyl-phthalide on aging were investigated. METHODS Butyl-phthalide were given to mice by ig and D-galactose were injected into mice for six weeks. Then ,the ability of study of mice ,the content of LPO,LF,the body weight ,the index of thymus and spleen,the activities of superoxide dismutarase(SOD),catalase(CAT) and whole blood glutothine peroxidase(GSH-PX) were determined. RESULTS To the D-galactose-induced aging mice,Butyl-phthalide (20,40mg.kg-1,ig) reduced the content of LPO,LF, inhibited the decrease of body weight and the weight of thymus and spleen,enhance the activities of SOD in brain,CAT in erythrocyte and whole blood GSH-PX. CONCLUSION Butyl-phthalide shows a remarkable anti-aging effect on the D-galactose-induced aging mice.
KRY WORDS Butyl-phthalide aging D-galactose mice
2.1.2仪器与试剂：
2.1.2.1仪器：721分光光度计、离心机、恒温水浴锅、匀浆器
2.1.2.2试剂：SOD反应液配置：
2.1.2.2.1 NBT：7.5×10-6M 配成10倍母液，取0.06133gNBT加少量PH7.8 50mM PBS稍加热溶解（60-70℃）定容至100ml；
2.1.2.2.2 Met：13×10-3M 配成10倍母液，取1.9397gMet加约50mlPH7.8 50mM PBS，加热溶解，最后定容至100ml；
2.1.2.2.3 EDTA：292.25×100×10-9M 配成100倍母液，0.29mg溶于100mlPH7.8 50mM PBS或者2.9mg溶于1000mlPH7.8 50mM PBS
2.1.2.2.4核黄素VB ：2×10-5M，4.5mg先加少量PH7.8 50mM PBS加热使VB充分溶解再加PH7.8 50mM PBS至500ml；
使用时取①10ml②10ml③1ml用④定容至100ml。
红细胞抽提液制备：
取尾血20ul加入2ml生理盐水，2000rpm离心3分钟，弃上清，沉淀加冰冷的双蒸水0.2ml混匀，加入95%乙醇0.1ml，振荡30s，再加入三氯甲烷0.1ml，置快速混合器抽提1min，4000rpm离心5min，分层，上层为SOD抽提液，中层为血红蛋白沉淀物，下层为三氯甲烷，记录上清液体积，用于SOD活性的测定。
2.2 过氧化脂质含量的测定
原理：MDA（malondiadehycle）是细胞膜脂质过氧化的终产物之一，测其含量可以间接估计脂质过氧化的程度。1个丙二醛（MDA）分子与2个硫代巴比妥酸（TBA）分子在酸性条件下共热，形成粉红色复合物，该物质在波长532nm有极大吸收峰，可用分光光度法进行检测。
仪器与试剂：
仪器：721分光光度计、微量加样器、恒温水浴锅、普通离心机、混旋器、具塞离心管。
试剂：0.2M乙酸盐缓冲液PH3.5
0.2M乙酸溶液 185ml
0.2M乙酸钠溶液 15ml
1mmol/l四乙氧基丙烷（储备液，4℃保存3个月），临用前用水稀释成10nmol/l
8.1%十二烷基磺酸钠SDS
0.8%硫代巴比妥酸TBA
0.2M磷酸盐缓冲液PH7.4
0.2M磷酸氢二钠 1920ml
0.2M磷酸二氢钠 480ml
样品制备：取全血10ul加入0.5ml0.2M磷酸盐缓冲液，2000rpm离心10分钟，取上清液待测。
样品测定：
试剂 空白管 样品管 标准管
10ul全血上清夜 0.1ml
10nmol/l四乙氧基丙烷 0.1ml
8.1%SDS 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml
0.2M乙酸盐缓冲液PH3.5 1.5 ml 1.5 ml 1.5 ml
0.8%TBA 1.5 ml 1.5 ml 1.5 ml
H2O 0.8 ml 0.7 ml 0.7ml
混匀，避光沸水浴60min，流水冷却，于532nm处比色
计算：
过氧化脂质（nmol/ml血液）=（B-A/F-A）×C×K
A：空白管吸光度
B：样品吸光度
F：四乙氧基丙烷吸光度
C：四乙氧基丙烷浓度
K：稀释倍数
