从绿豆（菜豆）豆荚水提取物中分离的免疫果胶多糖结构鉴定
从绿豆（菜豆）豆荚水提取物中分离的免疫果胶多糖结构鉴定
Pradip Patraa, Debsankar Dasa,
Birendra Beherab, Tapas K. Maitib, Syed S. Islama,*
a印度西孟加拉邦Midnapore721102维德雅瑟格大学化学化工系
b印度西孟加拉邦克勒格布尔721302印度理工学院（IIT）克勒格布尔分校生物技术系
文章信息
文章历史：
2011年8月15日收稿
2011年10月1日收到修订版
2011年10月17日接搞
2011年10月25日可在线阅读
关键词：菜豆；果胶；结构；核磁共振光谱；免疫活动；抗氧化性
摘要
通过透析、离心连续提纯从绿豆（菜豆）豆荚的热水提取物中分离的水溶性果胶多糖（PS-I），琼脂糖-6B凝胶通过过滤层析，发现D-半乳糖醛酸、D-半乳糖、L-阿拉伯糖甲基酯组成的摩尔比接近2:2:1。这种分子表明，脾、胸腺细胞的活化作用以及抗氧化性能。PS-I的结构研究是用酸水解，甲基化分析进行的，碘酸氧化的研究随着核磁共振分析（1H，13C，TOCSY，DQF-COSY，NOESY，ROESY，HMQC和HMBC），PS-I的重复单元被确定为：
1.引言
果胶多糖（果胶），是高等植物细胞的一个重要结构成分，特别是在水果和蔬菜中(Ridley，O’Neil，& Mohnen，2001；Voragen & Pilnik，1989)，是含有半乳糖醛酸或主链酯的复杂的异质多糖。这些都作为胶凝和增稠剂用在食品工业中并表现出不同的医药活性(Voragen，Pilnik，Thibault，Axelos，& Renard，1995)以及在某些生理过程的调控中发挥了重要作用，以防止高脂血症和肠癌(Lim，Yamada，& Nonaka，1998；Willats，McCartney，Mackie，& Knox，2001)。人参果胶可以抑制细菌粘附到宿主细胞上(Lee，Shim，Chung，Lim，& Kim，2009；Lee等，2006)，保护动物防止电离辐射对其致命的影响（Kim等，2007；宋等，2003），降低正常小鼠和糖尿病小鼠的血糖(Konno，Sugiyama，Kano，Takahashi，& Hikino，1984；Suzuki & Hiking，1989)并且也能抑制肿瘤的生长和转移(Kim，Kang，& Kim，1990；Shin等，2004)。从甜辣椒中使用使用受激胃癌培养基分离的果胶多糖，发现可以降低肿瘤坏死因子 TNF-α的释放和增加脂多糖受激全血中白细胞介素-10的产生(Popov等，2011)。在体外生物活性测试中，金钗石斛茎的果胶多糖表明，对T淋巴细胞和B淋巴细胞有着显著的免疫刺激活动(Wang，Luo，& Zha，2010)。
在本研究中，我们已经进行了结构表征和脾、胸腺细胞活化作用以及从绿豆豆荚分离的果胶多糖的抗氧化性（PS-I）的研究（菜豆），并在这里首次报告。
2.材料和方法
2.1.天然果胶多糖的分离，分馏和提纯
将从当地市场收集的绿豆（1.0公斤）用水清洗，然后压碎，最后在100℃的蒸馏水里煮沸12小时。通过亚麻布过滤后，将滤液在4℃温度10000 rpm的转速下离心（使用Heraeus Biofuge stratos离心机）45分钟，在乙醇中收集上层清液和沉淀物（1:5，v/v）。它被保存在4℃温度下一整夜后再次离心。用乙醇将沉淀物质清洗四次，用纤维素膜对蒸馏水透析48小时后然后冷冻干燥（Sigma-Aldrich公司，保留> MW12400）。然后从透析袋和冷冻烘干中收集水溶液，产生粗多糖（560毫克）。
将水中的（90厘米×2.1厘米）琼脂糖凝胶6B作为洗脱液（0.4毫升/分钟）用凝胶渗透色谱法纯化粗多糖（30毫克），使用Redifrac馏分收集。95试管（每个2毫升）被收集和用分光光度计在490 nm与苯酚 -硫酸试剂下使用型号-1601的Shimadzu UV-VIS 分光光度计监测(York，Darvill，McNeil，Stevenson，& Albersheim，1985)。两个部分（试管15-22和试管31-42）被收集并冷冻烘干，产生 Fr-I (PS-I)；8 mg，和Fr-II (PS-II)；8.5 mg。净化过程在几个地段进行收集，产生PS-I～68 mg和PS-II～73.5 mg。PS-I再次分别通过凝胶渗透色谱纯化，获得了均匀的峰值。
2.2.单糖分析
2.2.1.糖醇醋酸分析
PS-I（3.0毫克）用2M 三氟乙酸（2毫升）在100℃的圆底烧瓶的沸水浴中水解18小时。用水通过蒸馏将过剩的酸完全去除。然后，水解产物被分为两部分。其中一部分用纸层析在X和Y溶剂体系中进行检查(Hoffman，Lindberg，& Svensson，1972)。另一部分是被硼氢化钠（9毫克）降低，接着用稀醋酸酸化，然后纯甲醇蒸馏去除多余的硼酸。将减少的糖（糖醇）用1:1的吡啶醋酸酐沸水浴1小时乙酰化，来给糖醇提供乙酸酯，这被GLC分析。
2.2.2.制备少羧基果胶多糖
将PS-I（10.0毫克）溶解于pH为7.0的1 M咪唑盐酸缓冲液中（200微升/毫克）并在冰上冷却。然后加入硼氢化钠（40毫克），放在冰上反应至少1小时。通过加入冰醋酸（100微升/40毫克硼），使多余的硼被反应掉，然后慢慢冷却样品。然后加入等量的二次蒸馏水，通过加入3-4体积的95％（v/v）乙醇溶液（2毫升）沉淀减少的PS-I。样品用95％的乙醇再沉淀超过两次后冷冻干燥。少羧基-PS-I（Maness，Ryan，& Mort，1990）用2M三氟乙酸在100℃温度下水解18小时，在进行常规处理后，通过GLC来分析该糖。
2.3.甲基化分析
使用Ciucanu和Kerek（1984）的方法将PS-I（6毫克）甲基化。甲基化的产品通过氯仿和水（5:2，v/v）之间的分割区进行分离。将有机层包含的产品用5 mL水清洗三次并烘干。然后将甲基化的产品（2毫克）用90％甲酸（1毫升）在100℃的温度下水解1小时，减少的硼氢化钠用（1:1）醋酐-吡啶乙酰化后用GLC和GLC-MS分析。甲基化产品的另一部分（2.0毫克）被溶解于干燥的THF（2毫升），并与氢化铝锂（LAH）（40毫克）进行回流反应(Abdel-Akher &Smith, 1950) 5小时，并在室温下保持一整夜。过剩的还原剂通过乙酸乙酯和水四氢呋喃分解。无机材料被过滤掉。滤液蒸发至干，给全甲基羧基还原产物。该产品是与以前一样用甲酸和甲基化的糖醇乙酸酯水解，少羧基糖就制备好了，然后用GLC和GLC-MS分析。
2.4.高碘酸氧化
PS I（5毫克）在27℃的黑暗环境中用0.1M钠高碘（2毫升）氧化48小时。加入1,2 -乙二醇后去除过量的高碘，溶液用蒸馏水进行透析。用NaBH4 15小时将透析材料减少后，用醋酸中和。用甲醇蒸馏即得到了产生的材料。碘酸氧化物质 (Goldstein，Hay，Lewis，& Smith，1965；Hay，Lewis，& Smith，1965) 被分为三个部分。一个部分用2M三氟乙酸水解18小时，像往常一样糖醇醋酸被制备出来。另一部分通过Ciucanu和Kerek（1984）的方法甲基化，其次是糖醇醋酸的制备，这用GLC和GLC-MS分析。另一部分通过LAH被减少了，然后在室温下用0.5 M三氟乙酸保存48小时。酸被去除掉，水解产物用GLC分析（如糖醇醋酸）。 2.5.一般方法
旋光度用型号P-1020的Jasco旋光仪在25℃下测量。所有的GLC-MS实验在惠普5970 MSD仪器中使用HP-5毛细管柱进行。该方案在150℃的等温线进行；保持时间2分钟，以温度梯度为4℃ /分钟的速度上升到最终温度为200℃。纸分区色谱的研究（霍夫曼等人，1972）在Whatmann1号和3MM片材上进行。使用的溶剂体系为：（X）正丁醇-醋酸-水（4:1:5，v/v/v，上层）和（Y）乙酸乙酯-吡啶-水（8:2:1，v/v/v）。使用的喷雾试剂是呈碱性的硝酸银溶液。PS-I分子重量 (Hara，Kiho，Tanaka，& Ukai，1982) 使用凝胶色谱技术测定。标准葡聚糖T-200、T-70和T-40通过琼脂糖-6B柱传递，然后各自的分子量的对数绘制洗脱体积曲线。PS-I的洗脱体积绘制在同一张图上时，PS-I的平均分子量就确定了。
2.6.单糖的绝对构型
采用的方法基于Gerwig，Kamarling，&Vliegenthart（1978）。将PS-I（1.0毫克）用三氟乙酸水解，然后去除酸。在R-（+）2 -丁醇中加入250微升的0.625 M盐酸溶液，然后在80℃的温度加热16小时。然后反应物被蒸发，TMS衍生物与N,O-bis (trimethylsilyl) trifluroacetamide (BSTFA)一起被准备。产物通过GLC使用SPB -1毛细管柱（30米×0.26毫米）进行了分析，用升温程序（3℃ /分钟）将温度从150升到210℃。获得的2,3,4,6-tetra-O-TMS-(+)-2-butylglycosides通过对比不同的单糖D和L对映体获得。
2.7.核磁共振研究
将PS-I在真空中用五氧化二磷保持几天，然后通过与重水（99.96% atom 2H，Aldrich）冷冻干燥与氘交换(Duenas Chasco等，1997)四次。用Bruker Avance DPX-500光谱仪，1H，TOCSY，DQFCOSY，NOESY谱和HMBC NMR谱在27℃的重水中记录。1H NMR谱通过使用WEFT脉冲序列（H?rd，，Zadelhoff，Moonen，Kamerling，&Vliegenthart，1992）抑制HOD信号（在δ4.73 ppm固定）。TOCSY实验记录的混合时间为150毫秒，完成任务所需的TOCSY实验的混合时间范围从60到300毫秒。NOESY谱混合延迟是200毫秒。HMBC实验中延迟时间为80毫秒。
2.8.脾腺细胞和胸腺细胞的增殖试验
脾脏和胸腺单细胞悬浮液是从正常小鼠通过磨砂幻灯片在磷酸盐缓冲液（PBS）在无菌条件下制备的。细胞悬浮液通过离心获取细胞沉淀。感染性红细胞由溶血Gey的溶液去除。在PBS细胞洗涤两次后，在完整的RPMI（升井公园纪念研究所）介质重新悬浮。细胞浓度调整为1×105个细胞每毫升和悬浮细胞的存活率（台盼蓝排斥试验）一直都在90％以上。细胞（180升）接种于96孔平底板上和被培养于不同浓度的20升不同浓度 (10–200 g/mL) 的 PS-I和4克/毫升的脂多糖（内毒素，这是积极控制）中。培养基被放置在37℃温度，5％CO2饱和湿度下72小时。增殖情况通过使用MTT法检测方法（Ohno等人，1993年）检查。数据作为六种不同的平均值±标准偏差的意见报告，并与PBS控制组对比(Maiti等，2008；Sarangi，Ghosh，Bhutia，Mallick，& Maiti，2006)。
2.9.DPPH自由基的清除活性
PS-I的抗氧化活性根据Yen，Yang，& Mau（2008）所描述的方法在稳定的1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl（DPPH）清除活性自由基测试的基础上测定。样品溶解在0.2，0.5，1，2，4和8毫克/毫升的蒸馏水中。1毫升测试样品与2毫升新鲜配制的DPPH（0.1毫米）在50％的乙醇中混合。大力摇晃后，将混合物在25℃的黑暗环境中培养30分钟，然后在517 nm处测定吸光度。反应混合物的吸光度较低表示有较高的自由基清除活性。抗坏血酸被用来作为标准的抗氧化物质。DPPH自由基的清除活性的计算公式为：
其中Q是DPPH减少的百分比，A0是初始吸光度，AC是增加样品浓度C后的吸光度。
3.3.结果与讨论
3.1.果胶多糖的化学分析
两个多糖的分子量（Hara等，1982），PS-I和PS-II估计分别为～1.8×102 kDa和～2.0×102 kDa。在这里我们只报告PS-I的结构特征。PS-II多糖含有类似PS-I的糖单元，但摩尔比不同。稍后将通报。
纯果胶多糖（PS-I）显示了[α]D25 +112.0 (c 0.86，水）的特定旋转。PS-I水解糖醇醋酸的GLC分析表明了半乳糖的存在，阿拉伯糖的摩尔比接近2:1，但少羧基（Maness等，1990年）PS-I水解后的GC和GC-MS分析表明存在半乳糖，阿拉伯糖的摩尔比接近4:1。这些结果证实了目前PS-I中半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖的摩尔比是2:2:1。目前PS-I中的糖单元的绝对构型由Gerwig等人（1978）的方法确定，人们发现，半乳糖和半乳糖醛酸有D配置，而阿拉伯糖有L配置。甲基化的PS-I糖醇醋酸(Ciucanu & Kerek，1984)通过GC和GC-MS分析，表明了2,3,4,6-Me4-Gal；2,3,6-Me3-Gal；2,4-Me2-Ara的存在，摩尔比接近1:1:1。这一结果表明：终端galactopyranosyl的存在，（1→4）-linked galactopyranosyl和（1→3）连接阿拉伯糖基。甲基化的少羧基（Abdel-Akher & Smith，1950）PS-I表明，以上峰值的出现，随着2,3-Me2-Gal和3-Me-Gal两个相应新的峰值的摩尔比接近1:1:1:1。这一结果表明PS-I中 (1→4)-linked and (1→2,4)-linked GalpA的存在。
GLC分析后氧化的碘酸（Goldstein等，1965；Hay等，1965）物质，用2M三氟乙酸水解后，表明只存在阿拉伯糖。从氧化的碘酸获得的糖醇醋酸GLC分析，LAH降低了PS-I表明摩尔比为1:1的半乳糖和阿拉伯糖的存在。氧化的碘酸的GLC和GLC-MS分析，甲基化的PS-I表明了 2,4-Me2-Ara的存在。这一结果表明：终端galactopyranosyl的存在，（1→4）-linked galactopyranosyl和（1→4）-linked galacturonopyranosyl残留物在氧化过程中被完全摧毁。
3.2.NMR和果胶多糖的结构分析
在27℃下PS-I的核磁共振频谱（500兆赫，图1）表明，在δ5.13，5.06，4.93，4.62的四个信号的五个异头质子，其中信号在δ5.06容纳两个质子，其他三个信号相当于一个质子。在3.79 ppm的信号被观察到有甲基酯质子组。糖基根据其减少的异头质子的化学位移被指定为A-E（见表1）。在27℃下的13C NMR谱（125兆赫，图2）中，三个信号出现在δ104.8，100.8和100.3，其中在δ104.8和100.8的每个信号都容纳了两个碳原子。100.3 ppm的峰值对应于异头碳残留物C。在100.8的信号对应于异头碳残留物B和D。在104.8 ppm的峰值与A和E残留物的异头碳相关。甲基酯基碳信号出现在δ53.3 ppm。所有的1H和13C信号（见表1）被使用DQF-COSY，TOCSY，HMQC NMR实验分配。
图1.PS-I的1H NMR谱（500兆赫，重水，27℃），从绿豆（菜豆）豆荚中分离。
表1.PS-I的1H NMR和13C NMR谱化学移位，在重水27℃下绿豆（菜豆）豆荚中分离后记录?
表2.PS-I的NOESY谱数据，从绿豆（菜豆）豆荚分离。
残留物A被指定为β-L-Arap，这表明大型耦合常数的值 3J2,3 ～8.3 Hz，3J3,4 ～6 Hz，相对较小的耦合常数3J1,2以及两个H-5信号（δ3.91和3.94）。残留物A在δ5.13 的异头质子的化学移位和104.8 ppm的碳化学移位（1JC,H ～170 Hz）表明，这是一个联系的异头物。C-3（δ81.0 ppm）向下的移位和C-2（74.9 ppm）稍微向高场移位关于甲基葡萄糖苷的标准值(Agrawal，1992；Rinaudo & Vincendon，1982)表明它是(1→3)-β-L-Arap。
图2.PS-I的13C NMR谱（125兆赫，重水，27℃），从绿豆（菜豆）豆荚中分离。
图3.部分PS-I的NOESY谱，从绿豆（菜豆）豆荚中分离。NOESY谱搅拌时间为300毫秒。
图4.PS-I的HMBC谱，从绿豆（菜豆）豆荚中分离。HMBC实验中延迟时间为80毫秒。
残留物B在δ5.06 ppm 的异头质子的化学移位和δ100.8 ppm的碳化学移位（1JC,H ～170 Hz）表明，B是相连异头物。较大的3J2，3（8.5赫兹）和相对较小的3J3，4（3.7赫兹）的耦合常数表明B有半乳糖配置。残留物中C-2，C-3， C-4，C-5和C-6的化学移位类似于甲基苷的标准值，这表明残留物B是α-linked terminal D-galactose。
残留物C的自旋系统，其中包括只有五个相对较高的化学移位的H-5信号（δ4.43 ppm）和H-4与H-3、H-5的的弱耦合表明残留物C是D-GalpA。成分C在δ5.06 ppm和1JC，H?171赫兹的异头信号表明D-galacturonosyl残留物是α-linked。残留物C在δ78.0的C-4峰值表示低场的移位与标准甲基苷相比，由于糖基化的影响。残留物C的碳信号，分别在在δ68.4，69.2，72.2和171.2在相应的C-2，C-3，C-5和C-6（羰基碳）观察到。
在残留物D的情况下，在δ4.93 ppm出现的异头质子的化学移位和自旋系统也只有五个质子弱耦合常数3J3,4和3J4,5表明它的半乳糖配置。H-1的信号和3J1，2耦合常数值（<3赫兹）的特征，和1JC,H ～170 Hz表明残留物D是α-D-GalpA。C-2（79.2 ppm）的C-4（79.2 ppm）信号的低场移位与甲基苷的标准值相关，这表明，残留D是组（1→2,4）-linked moiety。分别在δ68.0，72.2和171.2观察到残留物的碳信号与C-3，C-5和C-6（羰基碳）有关。两个半乳糖醛酸的羰基甲基酯是由外在内残余耦合之间的酯羰基碳（δ171.1）和甲基质子（3.79 ppm）的在HMBC实验中证实。这一观察表明，残留物C是1,4-linked α-D-GalpA甲酯，残留物D是1,2,4-linked α-D-GalpA甲酯。
单元E（H-1-H-6）的所有的质子化学移位从DQF-COSY谱和TOSCY光谱中确定。耦合常数值3J1，2（?8.4赫兹）和1JC，H（?162赫兹）表示，它是β-linked 残留物。较大的3J2，3?9.3赫兹和相对较小的3J3，4?3.1赫兹表明残留物E有半乳糖配置。在4.62 ppm和104.8 ppm的异头质子的化学位移和碳移位分别支持了其配置。残留物E的低场C-4信号表明，PS-I的重复单元中它是（1→4）-linked成分。
图5.PS-I的不同浓度对 (a)脾细胞和（b）胸腺细胞增殖的影响。（c）从绿豆（菜豆）分离的PS-I对DPPH自由基的清除能力。结果表示为±标准差（n= 3）。
表3.在HMBC谱中观察到的显著3JH，C连通性，从绿豆（菜豆）豆荚中分离。
NOESY谱（图3和表2）以及ROESY（图略）实验确定的多糖的糖残留物序列。AH-1至E H-4；B H-1至A H-3；C H-1至D H-4；D H-1至C H-4；E H1至D H-2之间的内残余NOE接触进行了观察和建立了以下序列：
远距离HMBC实验的13C-1H相关性（图4）证实了ROESY和NOESY实验推导出的糖残留物序列。在HMBC谱之内和之间的跨残物的交叉峰如图4和表3。残留物间的交叉偶合，AH-1/EC-4；AC-1/EH-4；BH-1/AC-3；BC-1/AH-3；CH-1/DC-4；CC-1/DH-4；DH-1/CC-4；DC-1/CH-4；EH-1/DC-2；EC-1/DH-2在HMBC实验中观察到。因此，从NOESY谱和HMBC实验中，五糖重复单元的果胶多糖（PS-I）的结构被确定为：
3.3.脾腺细胞和胸腺细胞的增殖试验
脾腺细胞和胸腺细胞活化测试在小鼠的细胞培养液与PS-I中通过MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide]的方法进行。脾细胞和胸腺细胞的增殖是免疫刺激的指标（Ohno等人，1993年）。PS-I被测试来刺激脾细胞和胸腺细胞，如图5（a）和（b）所示。在PS-I100克/毫升，观察到脾细胞增殖指数是最高的，与其他浓度相比。因此，100克/毫升的PS-I，可以被视为对脾细胞增殖很有效的。25克/毫升的样品再次表明胸腺细胞增殖的影响最大。脾腺细胞和胸腺细胞的增殖指数与PBS（磷酸盐缓冲液）控制相比，如果接近100或以下则表明对免疫系统的刺激作用较低。从这些实验结果，清楚地知道PS-I可以作为一个有效的免疫刺激。
3.4.抗氧化性分析
图5（c）演示不同浓度的PS-I而造成的DPPH自由基清除活性。在8毫克/毫升的PS-I发现最大的DPPH自由基清除活性为72.5％。DPPH自由基的PS-I的EC50值为1.56毫克/毫升。PS-I的清除活性从2至8毫克/毫升稳步增长，而对抗坏血酸从0.5到2毫克/毫升，达到了最高值，这表明，PS-I对DPPH自由基清除活性小于抗坏血酸的，但它作为一种有效的抗氧化物质是可观的。
结论
从绿豆豆荚水提取物分离的水溶性果胶多糖（PS-I），通过凝胶过滤层析纯化。报告所含的果胶[→4)-α-D-GalpA6Me-(1→4)-α-D-GalpA6Me-(1→]作为一个分支，其中一个通过α-D-Galp-(1→3)-β-L-Arap-(1→4)-β-D-Galp-(1→发生在甲基果胶酶基的C-2位置。这种分子表现出显著的抗氧化性以及胸腺细胞和脾细胞活化性。在化学分析和核磁共振研究的基础上，PS-I的重复单元结构被确定为：
致谢
在此衷心的感谢S. Roy教授，主任，A.K. Sen (Junior)博士，IICB，Kolkata提供的仪器设备。感谢Kolkata百色学院的Mr. Barun Majumder准备的核磁共振光谱。感谢DST、印度政府承认许可项目（参考编号：SR/S1/OC-52/2006日期19/02/2007）。作者（P.P.）感谢CSIR提供的初等研究奖学金。
从绿豆（菜豆）豆荚水提取物中分离的免疫果胶多糖结构鉴定.doc
