酿酒酵母中高活性的锰超氧化物歧化酶的研究
酿酒酵母中高活性的锰超氧化物歧化酶的研究
Kevin Barnese，Yuewei Sheng，Troy A. Stich，Edith B. Gralla，R. David Britt，
Diane E. Cabelli，Joan Selver stone Valentine
加利福尼亚州90095加州大学洛杉矶分校化学与生物化学系，
韩国汉城120-750梨花女子大学仿生化学系，
加州95616加州大学戴维斯分校化学系，
纽约11973厄普顿布鲁克海文国家实验室化学系
2010年5月14日收稿；电子邮件：cabelli@bnl.gov；jsv@chem.ucla.edu
摘要：来自不同物种的锰超氧化物歧化酶（MnSOD）在消除高浓度的超氧阴离子（O2 -）的效率不同，是由于其产物抑制的不同程度。人类的MnSOD比细菌的MnSODs表现出相当高的产物抑制水平。为了调查产物抑制的机制和它是否是真核MnSODs的一个共同特点，我们从酿酒酵母（ScMnSOD）中提纯MnSOD。它是一个每单体有0.6当量锰的四聚物。ScMnSOD的催化活性用脉冲辐解进行了研究，并与人类和两种细菌（大肠杆菌和耐辐射球菌）的MnSODs进行了比较。出乎我们的意料的是，在这些MnSODs之间，ScMnSOD去除高浓度O2-是最有效的。产物抑制水平的尺度特征用选通值k2/k3表示，三者之间的大小分别为ScMnSOD>耐辐射球菌MnSOD>大肠杆菌MnSOD>人类MnSOD。虽然大多数MnSODs为氧化形式，ScMnSOD在Mn2 +的氧化状态中可以通过其光学和电子顺磁共振光谱分离。通过人类MnSOD与ScMnSOD的比较，发现可以阐明产物抑制起源的可能性。
锰超氧化物歧化酶（MnSOD）通过一种机制催化超氧阴离子（O2-）的歧化反应，这比其他SODs更复杂。特别是超氧化物的减少通过两个途径之一都可以进行。当O2-浓度相对比酶浓度（反应2）要低时，一个途径占主导地位，当[O2-]/ [MnSOD]的比值较高时（反应3和4），另一途径占主导地位。自相矛盾的结论是，当O2-含量水平升高时，MnSOD是一个不太有效的SOD催化剂。
在较高O2-浓度时催化活性的降低被公认为是由于O2-将Mn2+SOD 从内球氧化产生的Mn3 +过氧加合物形成的产物抑制造成的（反应3）。这个途径大大慢于反应2中外层球体氧化和质子途径。不同MnSODs产物抑制的相对水平可用动力学上的k2/k3值描述（见表1）。这个慢途径的贡献在人类MnSOD中尤为突出。因此，O2-的清除和过氧化氢的产生速度依赖于MnSOD和O2-以及具体MnSOD的产物抑制程度的相对水平。
表1.不同MnSODs的速度常数
细胞中超氧化物歧化酶的浓度被称为是一个变量；例如，最近已表明，瞬态O2-的爆发，被称为“超闪”，是在人类线粒体中形成的，创造更大的过氧化氢形成变化速率的可能性。然而，在人类MnSOD中较慢的产物抑制途径，将允许更多恒定的过氧化氢形成，甚至当O2-浓度不同的时候。
过氧化氢的低含量在哺乳动物细胞的许多信号调节过程中发挥了重要作用，包括细胞生长和分裂的速率。它已被提出，人类MnSOD较慢的途径出现在进化压力的反应，将细胞内过氧化氢水平控制得更紧密，以减少过氧化氢间接氧化损伤，并优化其信号功能。人类和细菌的MnSODs（见表1）确定的k2/k3值与这一假说是一致的。然而，不同MnSODs的结构研究，无论是野生型还是突变型，还没有揭示为什么这种酶的k2/k3值如此显著不同。
酿酒酵母作为单细胞模型被广泛应用于高等真核生物中，因为它与哺乳动物细胞非常相似。酿酒酵母也似乎没有人类细胞的过氧化氢敏感，目前已知的只在酿酒酵母蛋白质中检测到过氧化氢（YAP1p和Skn7p）参与了氧化应激保护的调节；一个更一般的信号作用尚未被发现。人类MnSOD和酿酒酵母MnSOD（ScMnSOD）是四聚物和局部线粒体基质，而大多数细菌的MnSODs是二聚物。此外，人类MnSOD与ScMnSOD比大肠杆菌和耐辐射球菌的MnSODs占据了更大的序列相似性（分别为62.2％、52.9％和54.5％）。公布的ScMnSOD活性不包括产物抑制程度的测定。因此，我们把注意力转移到ScMnSOD 的催化机制特征上，产物抑制途径高贡献的期望将被证明是真核MnSODs的共同属性。令人惊讶的是，我们发现，ScMnSOD迄今的特点反而比细菌MnSODs的产物抑制更少，甚至超越了抗辐射细菌耐辐射球菌的MnSOD的高活性。
ScMnSOD的基因，其中包括插入到质粒YEp352中的线粒体定位序列。酿酒酵母中的酶被过度表达，并使用Fridovich等修改协议提纯（辅助信息）。按尺寸分别用排阻色谱，质谱，ICPMS法，将蛋白质作为前导序列每单体有0.6当量锰的四聚物分离。
虽然这里报道动力学数据拟合匹配O2-实验脉冲的衰减，出了四个速率常数，但只有k2已经通过脉冲辐解直接测量。随着Mn3+SOD的产生，k2通过休息酶与亚化学计量的O2-的氧化测定，其中有近480纳米的特征吸收带（辅助信息）。不像其他的MnSODs，ScMnSOD被隔离在减少状态，无法直接测量k1。 k1、k3和k4通过在多种酶浓度（1-10μM）和初始O2-浓度（2-48μM）下观察O2-损失率（ε260=2000 M-1 cm-1）确定的，条件是使用PRWIN，而不是生理学，脉冲辐解的动力学研究是必要的。在表1中，速率常数与其他已知的MnSODs进行了比较。
图1.来自不同生物体的MnSODs与2.3μM (A) 和48 μM (B)O2-浓度的下降关系。ScMnSOD脉冲辐数据用黑色表示，而曲线用表1中的速率常数使用Kintecus电脑造型表示：耐辐射球菌（紫色）；大肠杆菌（绿色）和人类（蓝色）；所有的都在1μM的Mn中。
ScMnSOD的催化O2-歧化的能力被发现超过其他MnSODs的特点。在低浓度的O2-（[O2 -]≈[MnSOD]），损失的发现率与所有的四个酶是相似的（图1A）。然而，在高浓度（[O2]>>[MnSOD]），其活性的差异很明显（图1B）。在脉冲辐解中，采用的O2-最高浓度， 酶的活性顺序是酿酒酵母>耐辐射球菌> 大肠杆菌>人类，这与k2/k3顺序是相同的，表明决定因素是形成产物抑制状态的倾向性。
大多数已知的MnSODs以Mn3 +的氧化状态存在，但我们的ScMnSOD始终是分离的主要原因是Mn2 +SOD的减少；孤立ScMnSOD的电子吸收光谱缺乏最高近480纳米的可见光吸收带。据以前的报道，ScMn3+SOD的光学吸收谱相对其他的MnSODs是不寻常的，但我们通过使用脉冲辐解作为隔离ScMnSOD与O2-的反应中获得的ScMn3+SOD的频谱（图2A，点）与其他消光系数为～800 M-1 cm-1的MN3+SODs是非常相似的。在480 nm处测得的吸光度（图2A，线）比对应Mn2+状态中作为隔离酶的90％还要大。
图2.在Mn2 +的氧化状态ScMnSOD被分离出来。（A）隔离的ScMnSOD（线）和Mn3+SOD的电子吸收光谱在与O2-脉冲辐解（点）的反应后得到。（B）分离的ScMnSOD的EPR谱。仪器参数：温度，4.7 K；微波频率，9.685 GHz；微波功率，0.2mW；调制幅度，0.8 mT。
我们隔离的ScMnSOD的EPR谱还表明，这种酶的减少，是因为垂直模式的EPR谱与其他Mn2 +SODs相似，锰核（I= 5/2）分裂的超精细六线可以在geff= 6.0看到（图2B）。我们寻找Mn3 +（S=2）与EPR并行模式的整数自旋的证据，但我们的频谱缺乏重奏超精细模式，通常显示Mn3 +SOD（辅助信息）。
唯一的在Mn2 +氧化状态被分离的MnSOD酶是MnSODs突变的，最主要的是人体酶的Gln143突变。然而，静止的氧化状态的决定因素是未知的。
在体外培养的人体细胞和动物研究中，MnSOD活性水平的提高已显示可以减缓肿瘤的生长，它已被提出，这种作用与细胞内的H2O2含量有关。出于这个原因，为了改善我们理解基础上所观察到的产物抑制，人类MnSOD已尝试多次突变使细菌的蛋白质活性类似，但成效有限。如上所述，人类MnSOD与ScMnSOD比细菌酶占据了更大的序列相似性，两个真核细胞蛋白是四聚物，而细菌是二聚物。此外，ScMnSOD在k3上类似于细菌，都是小的，但在k4上类似于人体酶，都是大的。因此，要改善我们理解导致人类MnSOD不寻常的动力学性质的原因，与ScMnSOD比较/对比，它可能比细菌MnSODs更富有成效。酶之间结构的略微差异的研究，可能会给了解化学产物抑制机制提供关键。我们还将继续从其他生物的MnSOD的产物抑制中研究进化的意义。
致谢：这项工作得到了Grant DK46828、KOSEF/MEST、 J.S.V.、国立卫生研究院通过WCU项目（R31-2008-000-10010-0）的支持，Grant GM48242 到R.D.B的辐解研究在BNL辐射化学研究中心进行，Contract DE-AC02-98CH10886 与美国能源部的资助，及其化学科学部、地球科学、生物科学、基础能源科学办公室的支持。
可用辅助信息：ScMnSOD隔离细节，脉冲辐解，完整的参考文献2和EPR并行模式。这种材料可以通过互联网http://pubs.acs.org免费获得。
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