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  • 资源分类:生物农医
  • 适用专业:园林植物与观赏园艺
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资料简介
硕士论文-西兰花遗传转化体系的建立及其BO-ACO2基因转化的研究,共81页,41424字
摘要
以青花菜无菌苗为试材,以 MS 培养基为基本培养基进行了青花菜离体再生体系
的建立以及形态建成过程中生理生化变化的分析。结果表明:在所选用的子叶、下胚
轴、茎段、叶片(分带主脉和不带主脉)、叶柄外植体中,以下胚轴和茎段为再生的
最适外植体,其芽分化率可达 97%;其余所选外植体按芽分化率计依次为子叶、不带
主叶脉的叶片切块、带主叶脉的叶片切块、叶柄;外植体取材植株的苗龄不同,其培
养后的分化能力不同,萌发后 10d 的无菌苗和生根 15d 的试管苗分别为下胚轴和茎段
的最佳取材时期;在研究所涉及的生长调节剂中以 6-BA/IBA 对芽分化最有效,但不
同外植体对 6-BA/IBA 浓度和配比要求不同,下胚轴与茎段外植体以 4.0/0.3mg/L 为
最适;在 MS 培养基中附加 0.1mg/LNAA 对试管苗生根时间和生根质量均有良好作用。
对青花菜离体再生过程中生理生化变化分析表明,愈伤组织形成、不定芽分化均与其
组织内部大分子变化有关。可溶性蛋白质含量在整个过程中呈增加趋势,SDS-PAGE
电泳谱带显示伴随外植体组织细胞脱分化、愈伤组织增殖和芽分化有新的蛋白带出
现;过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、多酚氧化
酶(PPO)活性也随形态发生呈相应的变化趋势。
在此基础上用含有正向 BO-ACO2 表达载体和反向 BO-ACO2 表达载体的根癌农
杆菌进行了农杆菌介导的青花菜遗传转化体系的研究。结果表明:以子叶和下胚轴为
外植体时,芽分化阶段 Km 的筛选浓度分别为 20mg/L 和 30mg/L 时,筛选效果较好;
在芽苗生根阶段 Km 的筛选浓度以 15mg/L 为宜。抑菌抗生素以羧苄青霉素效果好,
使用浓度为 300mg/L。预培养提高了转化效果,最佳预培养时间为 2d。对转化过程
其他参数的研究表明:最佳侵染时间为 5min;侵染菌液的最适浓度为 OD600=0.2;最
适共培养时间为 72h;最适宜的维持培养时间为 20d。获得了 7 个拥有外源 BO-ACO2
基因的整合和卡那霉素抗性基因整合及其表达的转化体,被测阳性转化体达 100%。
关键词:青花菜;植株再生;ACC 氧化酶(BO-ACO2);遗传转化
目录
致谢…………… ⅰ
中文摘要…ⅱ
英文摘要……………ⅲ
前言………1
第一章 文献综述……………2
1.ACC 氧化酶的研究进展…2
2.芸薹属植物转基因研究进展………………3
2.1 建立高频再生体系的研究………………3
2.2 遗传转化程序的优化…6
第二章 青花菜高频再生体系建立及再生过程中生理生化变化的研究…………9
1.材料与方法………………9
1.1 实验材料………………9
1.1.1 植物材料…………9
1.1.2 生化试剂…………9
1.2 方法…9
1.2.1 再生体系的建立…9
1.2.1.1 青花菜无菌苗和外植体的获得9
1.2.1.2 芽分化培养基的筛选………10
1.2.1.3 生根培养基确定及再生植株驯化移栽………10
1.2.1.4 外植体类型对青花菜再生频率的影响………10
1.2.1.5 外植体年龄对青花菜再生频率的影响………10
1.2.2 青花菜离体形态发生过程中生理生化特性变化的研究……………11
1.2.2.1 试材的培养11
1.2.2.2 形态观察与生理生化指标的测定……………11
2. 结果与分析……………12
2.1 不同浓度和配比的 6-BA/IBA 对各类型外植体芽分化的影响…………12
2.1.1 不同浓度和配比的 6-BA/IBA 对子叶和下胚轴芽分化的影响………12
2.1.2 不同浓度和配比的 6-BA/IBA 对叶片切块、叶柄、茎段芽分化的影
响……15
2.1.3 不同苗龄的子叶、下胚轴、茎段对芽分化的影响16
2.2 不同浓度和配比的 6-BA/IAA 对子叶和下胚轴芽分化的影响……………18
2.3 不同浓度和配比的 6-BA/NAA 对子叶和下胚轴芽分化的影响……………19
2.4 生根培养基筛选……21
2.5 青花菜离体子叶与下胚轴生长周期中生理生化特性的变化……………21
2.5.1 离体再生过程中子叶与下胚轴形态观察…………21
2.5.2 可溶性蛋白含量和组分的变化…21
2.5.3 超氧化物歧化酶(SOD)活性的变化………………24
2.5.4 过氧化物酶(POD)活性的变化…25
2.5.5 过氧化氢酶(CAT)活性的变化…26
2.5.6 多酚氧化酶(PPO)活性的变化…27
3.讨论……28
3.1 外植体类型对芽分化的影响…………28
3.2 外植体年龄对芽分化的影响…………29
3.3 植物生长调节剂对芽分化的影响……29
3.4 形态发生与生理生化特性变化的相关性……………3 0
第三章 农杆菌介导的 BO-ACO2 基因转化青花菜的研究………31
1.材料与方法………………31
1.1 菌株、基因、质粒……31
1.2 植物材料……………31
1.3 培养基………………31
1.3.1 植物材料培养基31
1.3.2 细菌培养基……32
1.4 方法32
1.4.1 青花菜对卡那霉素(Km)的敏感性试验……………32
1.4.1.1 芽分化阶段 Km 浓度的确定…32
1.4.1.2 生根过程中 Km 浓度的确定…33
1.4.2 抑菌剂试验……33
1.4.3 转化……………33
1.4.3.1 预培养时间试验……………33
1.4.3.2 工程菌液制备………………33
1.4.3.3 侵染………34
1.4.3.4 共培养……34
1.4.3.5 除菌筛选…34
1.4.3.6 生根培养…34
1.4.4 转基因植株的 PCR 检测………… 34
1.4.4.1 植物总 DNA 的提取………… 34
1.1.4.2 转基因植株的 PCR 扩增…… 35
2.结果与分析………………35
2.1 青花菜对 Km 的敏感性试验……………35
2.1.1 芽分化阶段 Km 浓度的确定………36
2.1.2 Km 对不定芽生根的影响…………37
2.2 抑菌剂对青花菜子叶和下胚轴不定芽形成的影响……38
2.3 影响青花菜转化因素的研究…………39
2.3.1 预培养…………39
2.3.2 菌液浓度………40
2.3.3 侵染时间………41
2.3.4 共培养…………42
2.3.5 维持培养………43
2.4 转化体的分子鉴定…… …44
3.讨论……46
3.1 抑菌剂的选择与浓度对转化率的影响46
3.2 抗生素筛选浓度、方法和时间对转化率的影响………47
3.3 预培养对转化率的影响………………48
3.4 菌液浓度与侵染时间对侵染效果的影响………………48
3.5 共培养时间对转化频率的影响………49
3.6 转化体的获得和分子鉴定 49
结论……… 51
参考文献…53
图版………65
图版说明……… 71
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