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硕士论文-花生与其近缘野生种体细胞杂交法的基础研究，共76页，32665字
摘要
花生是重要的油料兼经济作物，但由于花生易受多种病虫害以及干旱等灾害的
影响，导致其产量和品质严重下降。花生近缘野生种具有抗病、抗逆性强，生物产
量高，品质优良等遗传基因，但由于花生与其近缘野生种存在的种间杂交不亲和等
原因，严重限制了野生资源的有效利用。体细胞杂交法能够克服这种杂交不亲和
性，使野生种的利用成为可能。而体细胞杂交法能否成功应用依赖于高频率植株再
生体系的建立。本研究首先对花生及其近缘野生种组织培养植株再生方法进行研
究，建立了高频率植株再生体系，在此基础上对原生质体培养和细胞融合进行了研
究。
1. 对 33 个花生品种 (品系) 的不同外植体和利用不同培养基诱导不定芽分化及
植株再生进行研究，结果表明：(1) 基因型对再生率有很大的影响，不同基因型的不
定芽分化率有明显差异。(2) 花生不同外植体分化不定芽的频率有很大的差异，幼叶
明显优于上胚轴、下胚轴和子叶。 (3) 诱导培养基中添加 NAA 和 BAP 的浓度不同
对以后再分化培养基上不定芽分化有较大影响。 (4)对花生不定芽诱导的条件进行优
化，筛选出比较适合花生不定芽诱导分化及植株再生的培养基组合为：不定芽诱导
培养基为 MSB5+1mg/L NAA+6mg/L BAP+4mg/L AgNO3+600mg/L CH+ 3%蔗糖＋
0.8%琼脂；植株再生培养基为 MSB5 + 4mg/L BAP＋4mg/L AgNO3+600mg/L CH+
3%蔗糖＋0.8%琼脂；生根培养基为 MSB5 + 0.5mg/L NAA＋4mg/L AgNO3+600mg/L
CH +3% 蔗糖＋0.8%琼脂。
2. 对花生及其近缘野生种胚性愈伤组织和体胚诱导进行研究表明：野生种胚性
愈伤组织形成培养基为 MSB5+10mg/L 2,4 D +4mg/L AgNO3+600mg/L CH +3% 蔗糖
＋0.8%琼脂。栽培种胚性愈伤组织或体胚的诱导培养基为 MSB5+15mg/L 2,4 D +
4mg/L AgNO3+600mg/L CH +3% 蔗糖＋0.8%琼脂，体胚萌发及植株再生培养基为
MSB5＋4 mg/L BAP＋4mg/L AgNO3+600mg/L CH +3% 蔗糖＋0.8%琼脂。
3.建立了悬浮细胞系，花生区组野生种 A . chacoensis 胚性愈伤组织在添加
15mg/L 2,4 D 、4mg/L AgNO3、600mg/L CH、0.5%PVP 和 3%蔗糖的 MSB5 液体培
养基中能很好的增殖，在液体培养基中继代培养 5－6 代后可形成稳定的胚性悬浮细
胞系（继代周期为 7 天）。
4. 对花生原生质体分离与培养条件进行研究。材料在含有 Cellulase ONOZUKA
RS ( 纤维素酶，2.0% ) 和 Pectolyase Y-23 (果胶酶，0.1%) 的酶液中，酶解处理 6－7
小时，酶解液中可观察到大量游离原生质体，经纯化处理后培养在添加 1mg/L NAA
和 6mg/L BAP 的固液双层培养基中， 3 天后可观察到细胞分裂，以后细胞继续分
裂。已得到 8823、鲁花 14 和白沙果等原生质体分裂形成的愈伤组织。
5. 对花生与其近缘野生种间细胞融合及培养方法进行研究。将栽培种 8823 体胚与
匍匐区组近缘野生种 A .rignoii 嫩茎分离的原生质体，用 PEG 法融合后，在添加
1mg/L NAA、6mg/L BAP、4mg/L AgNO3、600mg/L CH 和 3%蔗糖的 MSB5 培养基
上进行双层培养，2-3 天后观察到细胞分裂，后形成细胞团，8 周左右，形成直径达
1－2mm 左右的愈伤组织。
关键词 花生（A. hypogaea L.）；A . chacoensis ；A .rignoii ； 组织培养；原生质
体培养；细胞融合； 植株再生
目录
致谢…ⅰ
摘要…ⅱ
英文摘要…………………ⅲ
论文正文
一、前言…………………1
1 花生生产的意义………1
2 花生育种的研究进展…1
2.1 花生常规育种及其存在的问题……………1
2.2 花生属近缘野生种的优点及其应用前景…2
2.3 花生组织培养研究进展…………………3
2.4 花生原生质体培养及融合的研究进展……6
2.4.1 原生质体分离与培养的研究进展………6
2.4.2 原生质体融合与培养研究进展…………7
3 本研究的目的与内容…8
二 材料与方法…………10
1 花生幼叶不定芽诱导及植株再生…………10
1.1 供试材料…………10
1.2 方法……………10
1.2.1 基本培养基…………10
1.2.2 花生种子的萌发……10
1.2.3 幼叶外植体培养及不定芽诱导…………10
1.2.4 不同浓度添加物对幼叶不定芽诱导的影响…………………10
1.2.5 植株再生 ……12
1.2.6 驯化移栽…………12
2. 花生幼叶体细胞胚胎形成及植株再生…12
2.1 供试材料……………12
2.2 方法………………12
2.2.1 基本培养基………12
2.2.2 不同外植体对体胚诱导的影响………12
2.2.3 2,4-D 和毒锈啶对体胚的诱导的影响12
2.2.4 不同基因型对花生体胚的诱导的影响…………………12
2.2.5 植株再生………12
3 花生胚性愈伤的悬浮培养…………………13
3.1 供试材料………13
3.2 方法…………………13
3.2.1 花生胚性悬浮系的建立……………13
3.2.2 培养基中加入抗褐变剂………………13
4 花生原生质体分离与培养…………………13
4.1 供试材料………13
4.2 方法……………13
4.2.1 分离所需的酶及各种试剂……………13
4.2.2 花生原生质体的分离14
4.2.3 原生质体培养………16
4.2.4 原生质体培养所需的培养基…………16
5 花生原生质体融合与培养…………………16
5.1 供试材料………16
5.2 方法16
5.2.1 原生质体分离与融合融合………………18
5.2.2 融合处理后原生质体的培养…………18
三 结果与分析…………19
1 花生幼叶不定芽分化及植株再生……………19
1.1 培养基对花生种子萌发的影响……………19
1.2 NAA 和 BAP 对幼叶不定芽诱导的影响…19
1.3 不同浓度 AgNO3 对花生幼叶不定芽分化的影响……………20
1.4 CH ( 水解蛋白 ) 对花生幼叶不定芽诱导的影响……………20
1.5 不同基因型对花生幼叶不定芽发生的影响21
1.6 植株再生……………21
1.7 驯化移栽………23
2 花生幼叶体细胞胚胎诱导及植株再生………27
2.1 花生不同外植体对体胚诱导的影响……27
2.2 2,4-D 或毒锈啶对体胚诱导的影响………28
2.3 不同基因型花生对体胚的诱导的影响…28
2.4 植株再生……………31
3 花生胚性愈伤的悬浮培养…………………32
3.1 胚性愈伤悬浮系的培养………………32
3.2 抗褐变剂对悬浮培养的影响………………32
3.3 2,4-D 浓度对悬浮培养的影响…………32
4 花生及其近缘野生种原生质体的分离与培养32
4.1 花生原生质体的分离32
4.2 原生质体培养及愈伤组织的形成………37
4.2.1 不同培养基对原生质体培养的影响37
4.2.2 培养方法对原生质体分裂及愈伤组织形成的影响………41
4.2.3 PVP 对原生质体培养的影响…………41
5 花生原生质体的融合与培养………………41
5.1 原生质体的分离与融合………………41
5.2 融合处理后原生质体的培养……………41
四 讨论47
1 影响花生组织培养高频率植株再生因素的研究…………………47
1.1 外植体对不定芽发生的影响………………47
1. 2 基因型对不定芽和体胚发生的影响…47
1. 3 激素配比对不定芽和体胚发生的影响…47
1.4 不同添加物对不定芽发生的影响………48
1.5 花生胚性愈伤的悬浮培48
2 影响花生原生质体分离与培养的因子………49
3 花生原生质体的融合与培养…………………50
五 结论…………………53
参考文献………………55
附录…61
A.缩略语…………………61