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硕士论文-利用细胞融合技术创造花生新种质的基础研究，共69页，39636字
摘 要
对花生(Arachis hypogaea L.)组织培养不定芽诱导及再生条件进行研究，并建立了其
高效植株再生体系。结果表明：不定芽分化频率因外植体种类、叶龄和切段部位及基因
型的不同而异。幼叶明显优于上胚轴、下胚轴和子叶。幼叶中间切段优于叶片顶端和叶
片基部。适宜的诱导培养基为 MSB5+ 1mg/L NAA + 3～10 mg/L BAP，再分化培养基为 MSB5
+ 10 mg/LBAP 或 MSB5+3 mg/L BAP + 1 mg/L ABA。在上述培养基上相继培养，花生品种 8823
幼叶中间切段外植体分化不定芽频率达 91.6%以上。将形成不定芽的愈伤组织进一步转
移至添加 4 mg/L BAP 的培养基上，幼茎迅速伸长，再生植株频率达 100%。再生小植株转
移到新的基本培养基上生根，经驯化后移至田间，正常开花结果。
对花生体细胞胚诱导及植株再生条件进行研究。结果表明，Picloram 对体细胞胚的
诱导效果优于 2,4-D 和 NAA；不同花生基因型体细胞胚诱导率有很大的差别。
对花生原生质体分离和培养条件进行研究。分别利用花育 20 成熟胚萌发 5~6d 未展
开的幼叶和幼叶培养诱导形成的胚性愈伤组织为材料分离原生质体。为提高原生质体产
量和活力，对酶液组分进行研究，结果表明，酶液含有 2.0%纤维素酶 （Cellulase RS）、
0.2%果胶酶（Pectolyase Y-23）、0.7mol/L 甘露醇，并添加 120mg/L 抗坏血酸，酶解 10h,
原生质体产量和活力最高。
对花生与其近缘野生种间细胞融合及培养方法进行研究。将栽培种花生花育 22 体
细胞胚和匍匐区组近缘野生种 A. rigonii 幼茎分离得到的原生质体用 PEG 方法融合后，
培养在添加 1 mg/L NAA 和 6 mg/L BAP 的改良 MSB5 培养基中进行液体浅层培养。3
天后开始观察到细胞分裂，之后细胞继续分裂生长。培养 7~8 周后，形成小愈伤组织。
关键词:
花生；A. rigonii；组织培养；原生质体培养；细胞融合；愈伤组织形成；
植株再生
目录
中文摘要……I
英文摘要…...II
前言………..……………………..….1
1. 花生生产的意义与花生育种的研究进展…………..…..1
1.1 花生生产的意义……………...…1
1.2 花生育种研究进展…………..….1
1.3 花生属近缘野生植物对改良栽培花生的意义……...…2
1.3.1 花生属植物的组系划分……....2
1.3.2 花生属野生植物的种质多样性…………………...….2
1.3.3 花生属野生植物所具有的优异种质与应用前景...….2
1.4 体细胞杂交法与其在花生育种上的应用研究进展...…3
1.5 花生组织培养的研究进展…...…4
1.5.1 花生组织培养的发展概况...….4
1.5.2 花生通过胚胎发生的再生途径的研究进展……...….5
1.5.3 花生通过器官发生再生途径的研究进展………...….6
2. 原生质体培养的研究进展…...…..7
2.1 植物原生质体的特点……..…….8
2.2 原生质体的分离和纯化…..…….8
2.2.1 原生质体的分离…………..…..8
2.2.2 原生质体的纯化…………..…..9
2.3 原生质体活力的测定和活力识别方法…………………..........10
2.3.1 形态识别法………………..…10
2.3.2 胞质环流法………………..…10
2.3.3 染色法……………………..…10
2.3.4 氧电极法…………………..…10
2.4 影响原生质体分离的因素….....10
2.4.1 材料的种类和生理状况..……10
2.4.2 酶液组成…………………..…11
2.4.3 酶解条件…………………..…11
2.4.4 渗透压稳定剂……………..…11
2.5 原生质体培养……………….....11
2.5.1 培养方法…………………..…12
2.5.1.1 液体静止培养…………...…12
2.5.1.2 固体平板培养…………...…12
2.5.1.3 双层平板培养………..…….12
2.5.2 培养密度……………..………12
2.5.3 培养基的种类与成分……..…12
2.5.4 基因型…………………......…..13
2.5.6 植物原生质体培养的应用……………………..……13
2.5.5 环境因素……..………………13
2.6 植物原生质体融合…………………….................……13
3. 本研究的目的与内容………...…14
研究内容…………..………………..15
1. 花生组织培养不定芽分化及植株再生………...….…...15
1.1 材料与方法…..…..…………..…15
1.1.1 供试材料…………..............…15
1.1.2 方法………….……............…15
1.1.2.1 基本培养基和培养条件…….…………..……...…15
1.1.2.2 不定芽的诱导…..….…...…15
1.1.2.3 植株的再生……...……..….17
1.2 结果与分析………….……………………..………..…17
1.2.1 花生不同外植体分化不定芽的差异.……...…….....17
1.2.2 花生幼叶不同叶龄和叶切段分化不定芽的差异……………....……….....18
1.2.3 不同基因型花生幼叶分化不定芽的差异…………..19
1.2.4 NAA 和 BAP 浓度对花生幼叶不定芽分化的影响………………..…….…19
1.2.5 再分化培养基中添加激素对不定芽分化的影响…………………..……...21
1.2.6 植株再生………...……..........21
1.3 讨论……………..……..….…...21
1.4 结论…………………..…..……22
2. 花生组织培养体细胞胚发生及植株再生…..…….......26
2.1 材料与方法………………..…..26
2.1.1 供试材料和培养基………....26
2.1.2 不同激素处理比较…..……..26
2.1.3 不同花生品种（系）比较…………………….……26
2.1.4 植株再生……………..……...26
2.2 结果与分析…………..…….…..26
2.2.1 不同激素对体胚诱导的影响…………………..…...26
2.2.2 不同花生基因型对体胚发生的差异………...……..27
2.2.3 体胚萌发及植株再生....……..28
2.3 讨论……………………..……….28
2.4 结论……………………..…...….28
3. 花生原生质体分离、融合与培养………..…………....31
3.1 材料与方法…………………..….31
3.1.1 供试材料……………......…....31
3.1.2 胚性愈伤组织的诱导…...…...31
3.1.3 原生质体分离所用的酶………………..……....…...32
3.1.4 原生质体的分离和纯化………………..……….…..32
3.1.4.1 叶肉分离原生质体……………………..…………32
3.1.4.2 愈伤分离原生质体………..32
3.1.4.3 原生质体的纯化…..…....…32
3.1.5 原生质体活性测定…….…….32
3.1.6 原生质体产量的测定.......…...32
3.1.7 原生质体培养及愈伤组织的形成………...….……..34
3.1.8 原生质体的融合………..…....35
3.1.9 融合处理原生质体的培养…………………..….…...35
3.2 结果与分析…………………….36
3.2.1 原生质体分离……..………...36
3.2.1.1 酶液浓度对叶肉、胚性愈伤原生质体产量和活力的比较………..……36
3.2.1.2 甘露醇浓度对叶肉原生质体产量和活力的影响……………………..….37
3.2.1.3 酶解时间对叶肉原生质体产量和活力的影响…………………..……….38
3.2.1.4 酶液中添加抗坏血酸对叶肉原生质体活力的影响……………...……...39
3.2.2 原生质体培养及愈伤组织形成………………....…..39
3.2.3 愈伤组织增殖…………...…...39
3.2.4 原生质体的分离与融合……………………...……...40
3.2.5 融合原生质体的培养及愈伤组织的形成.…...……..40
3.3 讨论………….…………..……...40
3.4 结论……..…………………..…...41
附录…..……..44
参考文献…………………..………..45
导师组意见