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硕士论文-昆明小鼠胚胎干细胞分离培养及鉴定试验，共63页，35323字
摘 要
目的：
对胚胎干细胞（ESC）分离培养的研究，旨在摸索适合昆明小鼠 ESC 分离培养的方
法，以提高昆明小鼠 ESC 的建系率。
方法：
本试验分为两部分：饲养层的制备以及 KMmESC 的分离培养。饲养层包括 MEF 饲
养层和 bBMSC 饲养层。对 MEF 饲养层的制备采用两种方法：先消化离心，长满后采
用 MMC 处理，然后用 PBS-清洗后用做饲养层；另一种方法是 MMC 处理后，消化离心
接种贴壁后做饲养层。bBMSC 饲养层采用长满后用 MMC 处理 0h、0.5h、1h、1.5h、2h、
2.5h，选取合适的处理时间段，PBS-清洗后直接用做饲养层，并比较了 MEF 饲养层与
最佳时间段处理的 bBMSC 饲养层用做分离 ESC 的效果。
在试验中选用了三种不同发育阶段的胚胎（桑葚胚、囊胚和孵化囊胚）来进行分离
培养 ESC，并比较了初步增殖 ICM 与完全增殖 ICM 对 ESC 分离培养的效果。选取三种
胰酶 +EDTA 组合（ 0.25%胰酶 -0.04%EDTA、 0.20%胰酶-0.04%EDTA 和 0.02%胰酶
-0.04%EDTA），选取较好效果的酶浓度，然后分别采用机械分离、一次消化法、连续消
化法、连同饲养层一起消化法以及机械分离+酶消化法五种方法分离 ICM 和 ESC 集落，
比较五种方法对昆明小鼠 ESC 分离培养的影响。并且对分离筛选的 ESC 集落进行碱性
磷酸酶（AKP）检测、核型分析和体外分化潜能的检验。
结果：
1 丝裂霉素 C（MMC）处理 bBMSC1h、1.5h、2h 时效果较好，三个时间点无明显差
异（P>0.0 5）。小鼠胎儿成纤维细胞（MEF）作为饲养层细胞时与 bBMSC 作为饲养层
细胞时获得 5 代 ESC 的效果相比差异不显著（P>0.05）。
2 采用 0.02%胰酶-0.04%EDTA 消化的第二代 ESC 克隆率最高，所传代数最高，效果
较好，适合用于分离培养 ESC。
3 0.02%胰酶-0.04%EDTA 浓度下，采用连续消化法对 ESC 进行传代的效果最好，传
至 5 代的效率最高。
4 贴壁后初步增殖（贴壁后 24h）的 ICM 与贴壁后充分增殖（贴壁后 72-96h）的 ICM
在获得 ICM 率方面、分离昆明 ESC 的效果方面差异显著。早期增殖 ICM（94.6%，21.6%）
要显著高于充分增殖的 ICM（81.3%，10.4%）。
5 不同发育阶段的胚胎对 ESC 分离培养有很大的影响。孵化囊胚的与囊胚和桑葚胚
相比差异显著。
6 ESC 之间能够相互附着，具有自发形成 ES 集落的能力。
7 所得 ES 集落 AKP 检测呈阳性，核型正常，能够分化为多种类型的细胞。
关键词：KM mESC; 分离培养;
MEF; 鉴定
目 录
中文摘要……………….……… …………...1
英文摘要……………….……… …………...3
缩略符号………………..………………..….5
文献综述…….................1
1 ESC 的基本特性…….1
2 维持 ESC 自我更新、全能性、永久性的分子机制…….… ..2
3 ESC 的建立…………….………….…...………………….…...5
4 ESC 的分离培养………………….………7
5 ESC 的鉴定方法.…....8
6 影响 ESC 建系的因素…………….……..10
7 应用前景……….…...12
第一部分 饲养层的制备…………….……15
1 材料和方法….….….15
1.1 试验材料….……...15
1.1.1 试验动物.……….15
1.1.2 主要试剂及仪器……………….…….15
1.1.3 溶液配置方法………………….…….15
1.2 试验方法….……....15
1.2.1 MEF 饲养层的制备…….…………....15
1.2.2 bBMSC 饲养层的制备方法………... 17
2 结果与分析…………18
2.1 饲养层的制备结果……………….. …..18
2.1.1MEF 饲养层的制备结果……………..18
2.1.2 bBMSC 饲养层的制备结果…………19
2.2 讨论……………….21
第二部分 小鼠 ESC 的分离培养及鉴定...23
1 材料和方法………...23
1.1 材料………………23
1.1.1 实验动物……......23
1.1.2 主要试剂及仪器..23
1.1.3 基本溶液的配制………………….….23
1.1.4 ESC 培养液………..……...................23
1.1.5 检胚管及消化管的制作……….…....23
1.2 试验方法…………23
1.2.1 母鼠的超排处理.23
1.2.2 胚胎的获得及孵化………………….23
1.2.3 ESC 的分离培养.24
1.2.4 ESC 的鉴定…….24
2 结果与讨论………...25
2.1 结果………………25
2.1.1 昆明小鼠胚胎 ICM 的生长行为……25
2.1.2 形态学观察及 AKP 染色……………26
2.1.3 ESC 的核型分析鉴定……………….27
2.1.4 消化液浓度对昆明 ESC 的影响……………….………..27
2.1.5 消化方法对昆明 ESC 分离培养的影响……….………..28
2.1.6 MMC 处理 BMSCs 对 ICM 形成率的影响……….……29
2.1.7 不同饲养层对昆明小鼠 ESC 培养的影响………….......29
2.1.8 两种不同时期 ICM 对昆明小鼠 ESC 培养的影响………………...………..30
2.1.9 不同时期胚胎对昆明小鼠 ESC 培养的影响…………...30
2.1.10 ESC 自发形成典型集落.………….31
2.1.11 ESC 体外分化 ………………......31
2.2 讨论………….….32
结论………………….36
参考文献…………….37
附录………………….41
致谢………………….49