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硕士论文-精子载体法制备转基因猪的初步研究，共77页，47761字
摘 要
精子介导基因转移是以精子为载体，在受精时将外源目的基因导入卵母细胞，是目
前转基因动物研究中简单而高效的方法学之一。本试验主要研究了在猪精子介导基因转
移过程中精子与外源结合的影响因素，并对利用精子载体法制备转基因猪胚胎进行了初
步研究，为利用精子介导法生产转基因猪和其它转基因哺乳动物提供了技术参考。
本试验进行了如下研究
一、猪精子结合和内化外源基因的影响因素研究：精子结合和内化外源基因的效率
是精子介导转基因成功的关键。本试验以 DIG 标记的线性化 EGFP 作为示踪基因来检测
猪精子结合和内化外源基因的影响因素，结果表明：猪精子能够自发结合外源基因，结
合部位主要在精子顶体后区。精子结合外源 DNA 的阳性率随共孵育时间延长而增加，
在 37℃或 39℃时孵育 60 分钟后，阳性率不再增加；在 17℃时孵育 90 分钟后，阳性率
不再增加。在检查的 15 只公猪样本中，精子与外源 DNA 的结合率为 6.57%-35.81%，
内化率为 2.99%-24.66%，个体间差异显著（p<0.01）。精浆能够强烈抑制外源基因的结
合和内化，脂质体及 DMSO 能够显著提高转染效率。死精子能够结合外源基因，但不
能将其内化；反复冻融导致质膜破裂的精子对外源基因有更高的结合率，且不受个体影
响。
二、猪体外受精的研究：探讨猪胚胎体外生产过程中各环节的相关影响因素，以期
建立起一套行之有效的猪胚胎体外培养系统，为生产转基因猪胚胎提供技术支持。结果
表明：抽吸法从每只卵巢平均采得卵母细胞个数显著低于切割法和破碎法，但所得可用
卵母细胞率、成熟率均显著高于另两种方法；中等大小卵泡卵母细胞成熟率最高，小卵
泡的成熟率显著低于大、中卵泡；猪卵母细胞体外成熟最佳培养温度为 39℃；20 IU/ml
PMSG+10 IU/ml hCG 的激素组合最有利于猪卵母细胞的体外成熟；获能液中单独添加
肝素不能使猪卵母细胞受精，联合使用咖啡因和肝素可以提高受精率；TCM 199 不支持
胚胎越过 4-细胞发育阻断，NCSU-23 添加 BSA 的培养效果优于添加 FCS。
三、利用精子载体法体外生产转基因猪胚胎的研究：经过转染处理的精子体外受精
后卵裂率和 4-细胞率显著低于未转染的精子；试验共检测了 31 枚转染胚胎，其中有 4
枚 PCR 结果呈阳性，阳性率为 12.9%，试验结果证明了精子介导法生产转基因猪胚胎的
可行性，为下一步转基因胚胎的移植奠定了基础。
关键词：外源 DNA；精子；SMGT；体外受精；猪
目录
中文摘要 … … … …
英文摘要 … … … …
英文缩写词表 … …
前 言 ……………………
文献综述 … … … …
1 精子载体法生产转基因动物研究进展 …
1.1 精子携带外源基因进入胚胎的机理 …
1.2 精子介导基因转移的方法
1.2.1 外源 DNA 与精子直接孵育 … … … …
1.2.2 脂质体介导法 … … … …
1.2.3 电穿孔导入法 … … …
1.2.4 胞质内精子注射法 … …
1.2.5 曲细精管/睾丸注射法 …
1.3 影响转染效率的因素 … …
2 猪胚胎体外生产的研究进展
2.1 猪卵母细胞的体外成熟 …
2.1.1 生理因素 …
2.1.2 物理因素 …
2.1.3 化学因素 …
2.2 猪卵母细胞的体外受精 …
2.2.1 猪体外受精特点 … … …
2.2.2 影响猪体外受精效率的因素 … … … … 13
2.3 猪胚胎的体外培养 … … …
2.3.1 卵源性因素
2.3.2 精源性因素
2.3.3 培养条件对体外受精胚发育的影响
研究内容 … … … …
1 猪精子结合和内化外源基因的影响因素研究 … … …
1.1 材料与方法 …
1.1.1 试验动物 …
1.1.2 主要试剂药品 … … … …
1.1.3 DIG 标记线性 DNA … …
1.1.4 精液的采集与转染 … …
1.1.5 转染精子的免疫组化检测 … … … …
1.1.6 试验设计 …
1.1.7 统计分析 …
1.2 结果 … … … …
1.2.1 pEGFP-N1 质粒酶切鉴定 20
1.2.2 转染时间、温度和外源基因浓度的确定 … … …
1.2.3 不同个体精子结合和内化外源基因能力的比较
1.2.4 精浆对猪精子结合内化外源基因的影响 … … …
1.2.5 脂质体及 DMSO 对猪精子结合和内化外源基因的影响 … …
1.2.6 死精子结合和内化外源基因的特征
1.3 讨论 … … … …
2 猪体外受精的研究 … … … …
2.1 试验材料 … …
2.1.1 药品试剂 …
2.1.2 试验仪器 …
2.1.3 动物材料 …
2.2 试剂配制 … …
2.2.1 激素贮存液配制 … … …
2.2.2 L-半胱氨酸存储液的配制 … … … …
2.2.3 各种培养液的配制 … …
2.3 试验方法 … …
2.3.1 猪卵母细胞采集 … … …
2.3.2 猪卵泡液（pFF）的制备 … … … …
2.3.3 猪卵母细胞体外成熟培养 … … … …
2.3.4 卵母细胞成熟鉴定 … …
2.3.5 精子获能 …
2.3.6 体外受精 …
2.3.7 胚胎培养 …
2.4 试验设计 … …
2.4.1 不同采卵方法对猪卵母细胞回收与体外成熟的影响 … … …
2.4.2 不同直径卵泡猪卵母细胞对体外成熟的影响 …
2.4.3 不同培养温度对猪卵母细胞体外成熟的影响 …
2.4.4 不同激素水平对猪卵母细胞体外成熟的影响 …
2.4.5 获能液中添加咖啡因和肝素对猪卵母细胞体外受精的影响
2.4.6 不同培养液和蛋白质添加物对猪受精卵发育能力的影响 …
2.5 统计分析 … …
2.6 试验结果 … …
2.6.1 不同采卵方法对猪卵母细胞回收与体外成熟的影响 … … …
2.6.2 不同直径卵泡卵母细胞对体外成熟的影响 … …
2.6.3 不同培养温度对猪卵母细胞体外成熟的影响 …
2.6.4 不同激素水平对猪卵母细胞体外成熟的影响 …
2.6.5 获能液中添加咖啡因和肝素对猪卵母细胞体外受精的影响
2.6.6 不同培养液和蛋白质添加物对猪体外受精卵发育能力的影响 … … … …
2.6.7 试验图片 …
2.7 讨论 … … … …
2.7.1 不同采卵方法对猪卵母细胞回收与体外成熟的影响 … … …
2.7.2 不同直径卵泡猪卵母细胞对体外成熟的影响 …
2.7.3 不同培养温度对猪卵母细胞体外成熟的影 … …
2.7.4 不同激素水平对猪卵母细胞体外成熟的影响 …
2.7.5 获能液中添加咖啡因和肝素对猪卵母细胞体外受精的影响
2.7.6 不同培养液和蛋白质添加物对猪体外受精卵发育能力的影响 … … … …
3 利用精子载体法体外生产转基因猪胚胎
3.1 试验材料 … …
3.1.1 药品试剂 …
3.1.2 试验仪器 …
3.1.3 动物材料 …
3.2 试剂配制 … …
3.3 试验方法 … …
3.3.1 猪卵母细胞采集与体外成熟 … … … … 42
3.3.2 精子转染 …
3.3.3 精子获能 …
3.3.4 体外受精 …
3.3.5 胚胎培养 …
3.3.6 早期胚胎 PCR 检测 … …
3.4 统计分析 … …
3.5 试验结果 … …
3.5.1 精子转染对体外受精的影响 … … …
3.5.2 转染精子体外受精胚胎图片 … … …
3.5.3 早期胚胎 PCR 检测 … …
3.6 讨论 … … … …
全文结论 … … … …
参考文献 … … … …
附录 …
致谢 …
个人简介 … … … …