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  • 适用专业:临床兽医学
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资料简介
硕士论文-RNA干扰Hsp72基因对小鼠早期胚胎发育影响的研究,共55页,30284字
摘 要
RNA干扰(RNAi)现象普遍存在于生物体细胞中,在理论上已清楚其分子机制,
为蛋白质功能研究提供了新的方法。本研究设计合成了针对小鼠胚胎诱导型热休克蛋白
70(Hsp72)基因的瞬时干扰siRNA,旨在通过RNAi技术干扰Hsp72 基因的表达,以研
究Hsp72 基因沉默对小鼠早期胚胎发育的影响。试验通过RT-PCR和Western blot检测
Hsp72 mRNA和Hsp72 蛋白表达量,成功筛选出了对小鼠Hsp72 基因具有显著抑制效果
的siRNA,并借助LipofectamineTM 2000 转染小鼠 4-细胞期胚胎,通过分析胚胎的囊胚发
育率和孵出率,研究Hsp72 在保护胚胎抗热应激方面的作用。
试验方法:
1. 选择GenBank报道的小鼠Hsp72 基因序列上的 4 个位点,体外化学合成 4 对
siRNA,借助LipofectamineTM 2000 转染小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。试验分为 37℃对
照组和热应激组,热应激组包括 4 个siRNA组,阳性对照组,阴性对照组及空白对照组。
MEF在 37℃、5% CO2、100% RH条件下预平衡的DMEM培养液中培养。热应激组MEF
转染 6 h后更换为正常DMEM培养液,36 h后在 41℃、6% CO2条件下应激 2 h,之后通
过RT-PCR和Western blot检测细胞中Hsp72 mRNA和Hsp72 蛋白表达量,筛选出对小鼠
Hsp72 基因表达抑制效果显著的siRNA。
2. 将最佳siRNA72 瞬时转染 4-细胞期小鼠胚胎。试验分为 37℃对照组和热应激组,
热应激组包括siRNA72 组、阳性对照组、阴性对照组和空白对照组。胚胎在 37℃、5%
CO2、100% RH条件下预平衡的葡萄糖-CZB培养液中培养。热应激组胚胎转染 6 h后更
换为正常葡萄糖-CZB培养液。胚胎发育到囊胚后,热应激组在 41℃、6% CO2条件下热
应激 2 h,之后通过RT-PCR和Western blot检测Hsp72 mRNA和Hsp72 蛋白表达量。同时,
siRNA转染 4-细胞期胚胎后 48 h,统计各组胚胎由 4-细胞发育到囊胚的数目,热应激 48
h后,统计各组胚胎的孵出囊胚数目(包括正在孵出和已经孵出的囊胚)。计算囊胚发育
率和孵出率。
目录
中文摘要 .......... 1
英文摘要 .......... 3
缩略符号 ........Ⅰ
文献综述 .......... 1
第一章 热休克蛋白 70 在附植前胚胎中的表达及作用 ............ 1
1 前言 . 1
2 热休克蛋白 70 概述 . 1
2.1 热休克蛋白 70 的分类及生物学功能.......... 1
2.2 热休克蛋白 70 表达的基因调控..... 2
3 热休克蛋白 70 与早期胚胎发育........ 3
3.1 体内发育胚胎中热休克蛋白 70 的表达...... 3
3.2 体外培养胚胎中热休克蛋白 70 的表达...... 3
4 热休克蛋白 70 对胚胎的保护作用.... 4
4.1 提高胚胎的热耐力 4
4.2 分子伴侣作用 ........ 4
4.3 抗细胞凋亡作用 .... 5
4.4 抗氧化作用 ............ 5
5 热休克蛋白 70 对胚胎的不利影响.... 6
第二章 RNAi 的方法及其应用 7
1 前言 . 7
2 RNAi 的分子机理 ...... 7
2.1 siRNA 的生成 ......... 7
2.2 RISC 的形成 ........... 8
2.3 RNAi 效应.. 8
3 细胞中产生 siRNA 的方法 ... 9
3.1 长的 dsRNA ........... 9
3.2 siRNA ......... 9
3.3 siRNA 库 .. 10
3.4 DNA 载体介导的 RNAi .... 10
3.5 病毒载体介导的 RNAi..... 10
4 dsRNA 的转染方法 . 11
4.1 直接注射法 .......... 11
4.2 脂质体介导的转染法 ....... 11
4.3 电穿孔法 . 12
5 siRNA 干扰细胞特异功能基因的检测方法.. 12
5.1 RT-PCR 检测被干扰目的 mRNA 的转录水平........ 12
5.2 Western blot 分析被干扰基因的蛋白质表达水平... 12
6 展望及存在的问题 . 12
研究内容
试验一 RNA 干扰小鼠胚胎 Hsp72 基因有效序列筛选 ........... 14
1 试验材料 .... 14
1.1 试验动物 . 14
1.2 试剂与仪器 .......... 14
2 试验方法 .... 15
2.1 小鼠胚胎成纤维细胞的制备和培养.......... 15
2.2 siRNA 的化学合成 ............ 15
2.3 试验分组 . 16
2.4 siRNA-LipofectamineTM 2000 混合物的制备及细胞转染 ... 16
2.5 RT-PCR 检测细胞转染后 Hsp72 mRNA 的表达 .... 16
2.6 Western blot 检测细胞转染后 Hsp72 蛋白表达水平 ........... 18
2.7 数据处理 . 20
3 结果 ............ 20
3.1 siRNA 对 Hsp72 mRNA 表达的影响 ......... 20
3.2 siRNA 对 Hsp72 蛋白表达的影响 . 21
4 讨论 ............ 22
试验二 RNA 干扰 Hsp72 基因表达对小鼠早期胚胎发育的影响 ....... 24
1 试验材料 .... 24
1.1 试验动物 . 24
1.2 试剂与仪器 .......... 24
2 试验方法 .... 24
2.1 胚胎体外培养 ...... 24
2.2 siRNA 的选择 ....... 25
2.3 胚胎分组 . 25
2.4 siRNA-LipofectamineTM 2000 混合物的制备及胚胎转染 ... 25
2.5 RT-PCR 检测胚胎转染后 Hsp72 mRNA 的表达水平 ......... 25
2.6 Western blot 检测胚胎转染后 Hsp72 蛋白表达水平 ........... 26
2.7 胚胎发育率检测 .. 26
2.8 数据处理 . 26
3 结果 ............ 26
3.1 siRNA 对 Hsp72 mRNA 表达的影响 ......... 26
3.2 siRNA 对 Hsp72 蛋白表达的影响 . 27
3.3 胚胎发育率 .......... 28
4 讨论 ............ 28
结论 ........ 30
参考文献 ........ 31
致谢 ... 37
附录 .......... 38
攻读硕士学位期间发表的学术论文 ... 41
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