您现在正在浏览:首页 > 论文 > 生物农医 > 硕士论文-水貂生长激素真核重组质粒构建及其表达的研究

免费下载硕士论文-水貂生长激素真核重组质粒构建及其表达的研究

  • 资源类别:论文
  • 资源分类:生物农医
  • 适用专业:临床兽医学
  • 适用年级:大学
  • 上传用户:bearcatzhang
  • 文件格式:word
  • 文件大小:555.84KB
  • 上传时间:2011-7-21 23:36:02
  • 下载次数:8
  • 浏览次数:37

安全检测:瑞星:安全 诺顿:安全 卡巴:安全

资料简介
硕士论文-水貂生长激素真核重组质粒构建及其表达的研究,共68页,35102字
摘 要
本试验旨在研究水貂生长激素的克隆与表达,探索出批量生产的途径和方
法。试验通过构建真核表达质粒pPIC9K-mGH,转化到巴斯德毕赤酵母GS115,
利用含不同浓度G418(0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/ml)的YPD平板进一步
筛选多拷贝重组子。将多拷贝重组子用BMGY富集菌株,并用BMMY诱导表达
蛋白,每隔 24h取样一次并添加甲醇,使其终浓度为 1%。将取得的菌样,离心
取上清,TCA浓缩并进行SDS-PAGE和Western blot检测;通过构建真核表达质粒
pVAX1-mGH,利用LipofectamineTM 2000 转染到BHK-21 细胞中,用最小致死量
为 300μg/ml的G418 进行阳性细胞株的筛选,进行免疫细胞化学和ELISA检测蛋
白表达情况。本试验还将阳性重组质粒pVAX1-mGH注射到小鼠后肢的股四头肌,
分别于注射后 5、10、20、40、60d眼球采血,ELISA检测血清中mGH的含量,
同时取注射部位的肌肉组织进行免疫组织化学检测。试验结果如下:
1.重组质粒 pPIC9K-mGH 转化到巴斯德毕赤酵母 GS115 中,经含 4.00 mg/ml
G418 的 YPD 平板筛选出高拷贝细胞株,用 SDS-PAGE 检测 mGH 的表达。结果
显示,用 1%甲醇连续诱导 3d 后,目的蛋白的表达最多;Western blot 鉴定表明
目的蛋白在酵母中获得了表达。
2. 重组质粒 pVAX1-mGH 转染到哺乳动物 BHK-21 细胞中,经 G418 筛选
出阳性细胞株,免疫组化检测到目的蛋白在 BHK-21 细胞中获得了表达;ELISA
检测到目的蛋白具有较好的免疫原性,且转染后 48h,目的蛋白的表达量最多。
3. 重组质粒 pVAX1-mGH 注射到小鼠后肢的股四头肌后 40d,血清中目的蛋
白的含量最多,且 ELISA 检测到目的蛋白具有较好的免疫原性。免疫组织化学
检测到了特异性的目的蛋白,说明 mGH 在小鼠的肌纤维中得到了表达。
关键词:水貂;生长激素;表达;Western blot;ELISA;免疫组织化学
目录
中文摘要 1
英文摘要 2
缩略符号 ...............Ⅰ
文献综述 1
1 前言 .... 1
2 GH 的生理调控.... 1
3 生长激素的生物学功能 ...... 1
3.1 促进生长作用 .. 2
3.2 促进代谢作用 .. 2
3.3 GH 对内分泌腺体的作用.. 2
3.4 GH 对生殖功能的作用...... 2
4 GH 的基因表达.... 3
5 GHR 及其信号转导分子 ...... 3
6 生长激素的制备工艺 .......... 4
7 生长激素的使用方法 .......... 4
7.1 制成缓冲剂——注射法 ... 4
7.2 制成缓释剂——埋植法 ... 4
7.3 免疫法 .............. 4
8 真核表达系统 ..... 5
8.1 酵母表达系统 .. 5
8.2 昆虫细胞表达系统 ........... 6
8.3 哺乳动物细胞表达系统 ... 6
9 我国在生长激素方面的研究进展........ 7
10 生长激素的临床应用 ........ 8
11 水貂生长激素的临床应用. 8
研究内容
试验一 pPIC9K-mGH 真核重组质粒的构建及在巴斯德毕赤酵母中的表达 ..... 10
1 试验材料 ........... 10
1.1 质粒和菌株 .... 10
1.2 试剂 ................ 11
1.3 仪器设备 ........ 11
2 试验方法 ........... 11
2.1 人工合成水貂生长激素 . 11
2.2 引物的设计与合成 ......... 11
2.3 PMD-mGH 质粒的大量提取............ 12
2.4 pPIC9K-mGH 重组质粒的构建 ....... 13
2.5 重组质粒对巴斯德毕赤酵母 GS115 的转化.... 15
2.6 阳性转化子的抗性筛选和鉴定........ 16
2.7 重组基因工程酵母菌的诱导表达.... 17
3 结果 .. 19
3.1 重组质粒的构建及鉴定 . 19
3.2 重组质粒 pPIC9K-mGH 的菌液 PCR.............. 21
3.3 重组质粒 pPIC9K-mGH 的双酶切鉴定 .......... 21
3.4 PCR 鉴定 pPIC9K-mGH 是否整合到酵母 GS115 基因组 ................ 22
3.5 多拷贝酵母菌转化子的筛选........... 23
3.6 mGH 在酵母表达产物的 SDS-PAGE 检测 ...... 23
3.7 表达产物的 Western blot 鉴定 ......... 24
4 讨论 .. 24
4.1 表达系统的筛选 .............. 24
4.2 发酵条件的优化 ............. 25
4.3 防止目的蛋白降解 ......... 25
试验二 pVAX1-mGH 重组质粒的构建及在 BHK-21 细胞、小鼠肌肉组织的表达 ............ 26
1 试验材料 ........... 26
1.1 试验动物 ........ 26
1.2 质粒、细胞与菌株 ......... 26
1.3 试剂 ................ 26
1.4 仪器设备 ........ 26
2 试验方法 ........... 27
2.1 人工合成水貂生长激素 . 27
2.2 引物的设计与合成 ......... 27
2.3 pVAX1-mGH 重组质粒的构建 ........ 27
2.4 细胞培养 ........ 28
2.5 转染用重组质粒的制备 . 28
2.6 重组质粒转染 BHK-21 细胞及表达产物的检测 ............. 28
2.7 重组质粒在小鼠骨骼肌中的表达及产物的检测............. 30
2.8 数据处理 ......... 33
3 结果 .. 33
3.1 重组质粒的构建及鉴定 . 33
3.2 pVAX1-mGH 在 BHK-21 细胞中的表达 ......... 36
3.3 免疫组化检测小鼠注射质粒部位骨骼肌中 mGH 的表达 ............... 37
3.4 ELISA 检测小鼠血清中 mGH 的含量 ............. 37
4 讨论 .. 38
结论 ............... 40
参考文献 ............... 41
致谢 ...... 46
附录 47
攻读硕士学位期间发表的学术论文 ..... 54
资料文件预览
共1文件夹,1个文件,文件总大小:1.04MB,压缩后大小:555.84KB
  • 硕士论文-水貂生长激素真核重组质粒构建及其表达的研究
    • Microsoft Word文档硕士论文-水貂生长激素真核重组质粒构建及其表达的研究.doc  [1.04MB]
下载地址
资料评论
注意事项
下载FAQ:
Q: 为什么我下载的文件打不开?
A: 本站所有资源如无特殊说明,解压密码都是www.xuehai.net,如果无法解压,请下载最新的WinRAR软件。
Q: 我的学海币不多了,如何获取学海币?
A: 上传优质资源可以获取学海币,详细见学海币规则
Q: 为什么我下载不了,但学海币却被扣了?
A: 由于下载人数众多,下载服务器做了并发的限制。请稍后再试,48小时内多次下载不会重复扣学海币。
下载本文件意味着您已经同意遵守以下协议
1. 文件的所有权益归上传用户所有。
2. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
3. 学海网仅提供交流平台,并不能对任何下载内容负责。
4. 下载文件中如有侵权或不适当内容,请与我们联系,我们立即纠正。
5. 本站不保证提供的下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。
返回顶部