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硕士论文-根癌农杆菌介导BG2基因遗传转化花生的研究，共63页，31451字
摘要
花生是重要的油料兼经济作物，真菌病害是花生的主要病害，导致其产量和
品质严重下降。单纯依靠常规育种方法很难选育出对真菌病害高抗的品种。而利
用遗传转化将外源基因导入花生栽培种则应具有一定的可行性。本研究首先对花
生组织培养植株再生方法进行研究，建立了胚小叶高效再生体系，然后利用遗传
转化体系，通过农杆菌介导法，将β-1，3-葡聚糖酶基因转入花生品种花育 22，
以提高花生抗病性。主要研究结果如下：
1.利用 8 个花生品种对花生组织培养进行研究，结果表明：（1）基因型对再
生率有很大影响，不同花生品种的愈伤组织形成和不定芽发生有明显的差异。2）
花生外植体对花生组织培养的植株再生具有很大影响，胚小叶的芽诱导率明显高
于子叶、胚轴、胚根等其它外植体。 3）胚小叶的叶龄对不定芽诱导有很大影响，
萌发 5、6 天的种子的胚小叶有利于诱导不定芽的形成，其中萌发 6d 的胚小叶最
高，芽诱导率为 91.3%。（4）以花生胚小叶作为外植体用于组织培养离体再生，
具有取材简单，来源丰富，再生率高的优点，可将其用于农杆菌介导的基因转化。
（5）不同培养基对不定芽的伸长有很大影响，试验发现，添加 4 mg/L BAP 的培
养基，芽伸长比较明显，添加 10mg/L BAP 的培养基中芽丛生明显。
2. 确定了 km 的选择压，芽诱导培养基中添加 km 最低浓度为 50mg/L 可有
效抑制非转化愈伤组织的形成或芽再生。添加 500mg/L Cb 可有效抑制农杆菌
LBA4404 的生长，且对花生外植体的再生无显著影响。
3. 对农杆菌介导遗传转化的适宜条件进行研究，结果表明：（1）预培养 3
天的花生胚小叶外植体最适宜进行基因转化。 2）菌液浓度对转化率影响较大，
以 OD600=0.4 为最好。（3）适宜侵染时间为 10-15min，转化率较高。（4）农杆菌
共培养时间 3d，转化率较高。（5）种子萌发后 6d 的胚小叶为受体转化效果最
好。
4.将β-1，3-葡聚糖酶基因转入花生栽培品种。 利用优化的遗传转化体系，
以萌发 6d 的花生品种花育 22 的胚小叶为外植体，经农杆菌 LBA4404 侵染，Km
筛选和标记基因 PCR 检测，得到目的基因转化植株。
5．确立了农杆菌介导途径进行花生遗传转化的技术规程:选用花生品种白
沙 1016 或花育 22 的成熟饱满的种子。经表面消毒后，接种于催芽培养基上，
取萌发 6d 的胚小叶，接种于 MSB5+6.0mg/L BAP+1.0 mg/L NAA 培养基上预培
养 3d。用活化的农杆菌重悬浮菌液（OD600=0.4）浸染 10-15min，共培养 3d，经
700mg/L Cb 浸 泡 冲 洗 后 ， 转 接 到 MSB5+6.0mg/L BAP+1.0 mg/L
NAA+50Km+500Cb 筛选培养基上继续培养。3w 后，将带抗性芽点的愈伤转接
到 MSB5+10mg/L BAP+50Km+500Cb 的再生筛选培养基上诱导丛生芽。2w 后将
丛生芽转接到 MSB5+10mg/L BAP+50Km+500Cb 的培养基上促进芽的伸长，每
2w 继代一次。当芽伸长到 3-4cm，转到 MSB5+0.5mg/LNAA+50Km+500Cb 培养
基中诱导生根。
关键词：花生（A. hypogaea L.）；再生体系；根癌农杆菌；遗传转化；β-1，3-
葡聚糖酶基因（BG2）
目录
中文摘要 ................i
英文摘要 ..............iii
前言 …………….…………1
1 花生育种生产及转基因研究的意义..... 1
1．1 花生生产的意义............ 1
1．2 花生转基因研究的意义 2
2 花生转基因研究进展........... 3
2.1 花生组织培养.. 3
2.2 花生遗传转化研究进展.... 5
2.2.1 基因枪介导转化法......... 6
2.2.2 电击穿孔法... 6
2.2.3 微注射法和花粉管通道法............... 6
2.2.4 农杆菌介导法................. 7
3 本研究的目的和意义.......... 8
材料与方法 ........... 9
1.花生再生体系的优化........... 9
1.1 供试材料 ......... 9
1.2 试验方法 ........ 9
1.2.1 基本培养基.. 9
1.2.2 不同花生品种愈伤组织形成及不定芽发生的差异........... 9
1.2.3 不同叶龄胚小叶不定芽诱导比较... 9
1.2.4 不同外植体不定芽诱导比较......... 10
1.2.5 不定芽伸长. 11
1.2.6 诱导生根..... 11
2.花生遗传转化体系的建立. 11
2.1 试验材料 ....... 11
2.1.1 植物材料..... 11
2.1.2 质粒与菌株. 11
i
2.1.3 试剂 ............ 11
2.1.4 主要仪器..... 11
2.2 试验方法 ...... 11
2.2.1 培养基 ........ 11
2.2.2 试剂配制..... 12
2.2.3 质粒载体中目的基因的 PCR 鉴定 ................. 12
2.2.4 菌活力曲线的测定....... 13
2.2.5 Km 选择压的确定........ 13
2.2.6 花生胚小叶转化条件的优化......... 14
2.2.7 外源基因的提取检测... 15
结果与分析 ......... 17
1. 花生胚小叶组织培养及植株再生体系的建立... 17
1.1 不同花生品种愈伤组织的形成及不定芽发生的影响 ........ 17
1.2 胚小叶叶龄对不定芽诱导的影响.... 18
1.3 不同外植体对花生芽点发生的影响 18
1.4 不定芽伸长.... 19
1.5 诱导生根 ...... 20
2.根癌农杆菌介导花生的遗传转化....... 23
2.1 植物表达载体的 PCR 鉴定 .............. 23
2.1.1 农杆菌质粒 DNA 的提取 ............. 23
2.1.2 表达载体的鉴定........... 23
2.1.3 农杆菌 LBA4404 抗生素敏感性试验............. 24
2.2 农杆菌 LBA4404 菌活力曲线的测定................ 24
2.3 km 筛选压的确定 ........... 26
2.4 不同叶龄胚小叶对转化率的影响.... 28
2.5 预培养时间对花生遗传转化的影响 28
2.6 菌液浓度对转化率的影响试验....... 29
2.7 农杆菌侵染时间对花生遗传转化的影响.......... 30
2.8 农杆菌共培养时间对花生遗传转化的影响...... 31
2.9 Km 抗性植株的获得....... 32
ii
2.10 转化植株的鉴定............ 34
讨论 ... 35
1．花生胚小叶组织培养再生体系的优化.............. 35
1.1 不同花生外植体不定芽发生的差异 35
1.2 关于基因型对植物组织培养的影响 36
1.3 关于胚小叶再生技术问题................ 36
2．农杆菌介导的遗传转化.. 36
2.1 关于影响转化效率的因素的探讨.... 36
2.1.1 预培养时间. 36
2.1.2 关于菌液浓度............... 37
2.1.3 关于侵染时间............... 37
2.1.4 关于共培养时间........... 37
2.2 关于材料污染问题......... 38
2.3 关于外植体的褐化.......... 38
结论 ... 39
花生胚小叶再生体系的建立和优化 39
农杆菌介导的遗传转化.. 39
参考文献 …………...……41
附录 I 植物表达载体 pATC BG2 的构建..45
附录 II 部分英文对照缩写词 ………….....46
附录 III 本实验主要仪器及产地…………...47
致谢…………….…………48