青天葵活性部位的体外抗肿瘤作用研究
青天葵活性部位的体外抗肿瘤作用研究
【摘要】 目的确定广西特产药材青天葵体外抗肿瘤作用的活性部位。方法青天葵部位提取物的制备主要采用溶剂法, 青天葵全草先用95%的乙醇提取，得到的提取物进一步用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇、甲醇依次提取，得到极性由小到大的4个提取部位。活性筛选采用MTT法实验，观察青天葵提取物对7种肿瘤细胞的生长抑制作用。结果青天葵石油醚和醋酸乙酯部位具有一定的体外抗肿瘤作用。结论首次确定了青天葵的石油醚和醋酸乙酯部分是体外抗肿瘤作用的有效部位。
【关键词】 青天葵 体外抗肿瘤作用 活性部位
Abstract：ObjectiveTo determine the active fraction with anticancer effect in vitro from Nervilia foadii(Hance) Schltr.MethodsThe samples were prepared by solvent extraction. The whole Nervilia foadii(Hance) Schltr. was extracted with 95% ethanol at first,and then the ethanolic extract was separated with petroleum ether, ethyl acetate, n-Butyl alcohol and methanol in turn to get four fractions from small to large in polarity. The MTT experiment was made for active screening. The inhibiting influences of extracts from Nervilia foadii(Hance) Schltr. on growth of seven kinds of human tumor cells were observed. ResultsPetroleum ether extract and ethyl acetate extract both had some anticancer effects in vitro. ConclusionIt is the first time that the petroleum ether extract and ethyl acetate extract of Nervilia foadii(Hance) Schltr. are proved to be the effective anticancer fractions in vitro.
Key words： Nervilia fordii(Hance) Schltr., Anticancer effect in vitro, Active fraction
青天葵为兰科Orchidaceae植物毛唇芋兰Nervilia
foadii(Hance) Schltr.的干燥全草，入药始载于《岭南采药录》，主要产于我国的广西、广东、海南，四川、云南，泰国也有分布，是广西特产药材［1～3］，具有清肺止咳、健脾消积、镇痛止痛、散淤消肿、清热解毒之功效，主治肺痨、咳嗽咳血、中毒、跌打损伤、小儿疳积、精神病、口腔炎、急性咽喉炎等症。近来还用含有青天葵的复方制剂治疗鼻咽癌以缓解症状［4］，但未发现国内外对其抗肿瘤有效成分及药理作用的研究。为此，笔者对青天葵的干燥全草进行了药效学实验研究，对青天葵的石油醚、氯仿、醋酸乙酯、甲醇4个不同部位采用体外抗肿瘤实验进行初筛，为阐明青天葵的抗肿瘤作用并筛选出有效部位打下基础。现报道如下。
1 材料与仪器
1.1 受试样品
药材青天葵来源于南宁药材站，经广西中医学院刘寿养副教授鉴定为兰科Orchidaceae植物毛唇芋兰Nervilia foadii(Hance) Schltr.的干燥全草。对青天葵的干燥全草进行提取分离得4个部位：石油醚提取物（A）、醋酸乙酯提取物（B）、正丁醇提取物（C）、乙醇提取物（D）。A，B，C和D均用含有DMSO的培养液溶解，均配成浓度为480 μg/ml的溶液，置于-20℃冰箱密闭避光保存。临用前用不含血清和抗生素的RPMI1640（NG108-15用DMEM）液稀释至所需浓度，DMSO终浓度在0.01%水平。
1.2 培养液
1.2.1 RPMI完全培养液含RPMI1640培养基（GIBCO）、3%谷氨酰胺、卡那霉素750 μg/ml、10% FBS（临用前加）。
1.2.2 DMEM完全培养液含DMEM培养基（GIBCO）、卡那霉素750μg/ml、10%FBS（临用前加）。
1.3 细胞株 白血病细胞株L1210和P388D1、宫颈癌细胞株Hela、人胃癌细胞株SGC7901、黑色素瘤细胞株B16、神经肿瘤细胞株NG108-15等均购自上海细胞生物研究所细胞库，人肝癌细胞株Hela7404由广西医科大学药理教研室提供。
1.4 试剂
MTT（四甲基噻唑蓝）为德国Sigma公司产品，批号020609；FBS（胚胎牛血清）为美国Hyclone公司产品，批号0405；RPMI1640和DMEM培养基为GIBCO公司产品，批号1120708和0311；Trypsin（胰蛋白酶）由天津市灏洋生物制品有限责任公司提供，批号200503；DMSO（二甲基亚砜）由天津汇英化学试剂有限公司提供，批号20040526。
1.5 细胞培养肿瘤细胞用含10%灭活新生小牛血清的RPMI1640（NG108-15肿瘤细胞用DMEM）培养基在37℃，15%CO2条件下培养，取对数生长期细胞用于实验。
1. 6 仪器
Thermo Forma型CO2培养箱，美国产；Olympus型倒置显微镜，日本产；Biocell型酶标仪，奥地利产；AG135型电子天平，瑞士产；培养瓶，美国产；3072型96孔板，丹麦产；3001型培养皿，美国产；DLF560型超净工作台，荷兰产；HV-50自动高压灭菌器，日本产。
2 方法
2.1 样品的提取分离
将青天葵药材阴干，去除杂质，粉碎为粗粉，称取9.0 kg药材粗粉，用95%乙醇（食用）浸泡48 h后渗滤提取，用10倍量乙醇提取。合并乙醇提取液，减压回收乙醇，得粗提物，干燥后得921.3 g（得膏率10.2%）。将所得的粗提物用硅胶拌匀后，依次用石油醚（60～90℃）、醋酸乙酯、正丁醇、甲醇回流提取，回收溶剂，得石油醚部位180 g，醋酸乙酯部位87.5 g，正丁醇部位86 g，甲醇部位50 g。
2.2 MTT法
取对数生长期细胞以0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化后，用培养液稀释。在96孔培养板中每孔加入200 μl（含有5 000个/ml肿瘤细胞）含10%FBS的RPMI1640培养液，NG108-15细胞则用含10%FBS的DMEM培养液，细胞置37℃，10%CO2培养24 h后，实验组分别加入最终浓度为15，30，60，120，240 μg/ml提取物的培养液，对照组则加入等体积溶剂的培养液，每组4孔，重复4次。置37℃，10%CO2培养5 d后，弃去上清液，加入200 μl/孔新鲜配置的含0.2 mg/ml MTT的无血清培养液，37℃继续培养4 h，弃上清液，加入200 μl DMSO，振荡混匀后，在酶标仪上以波长为550 nm，参比波长为450 nm测定OD值。
2.3 药物对肿瘤细胞生长的抑制率的计算方法［5］
肿瘤细胞生长抑制率（%）=［（1-实验组平均OD值）/对照组平均OD值］×100%
2.4 半数抑制浓度ⅠC50的计算
2.4.1 直线回归法［6］
当细胞生长抑制率与药物浓度有对数关系时，以各个不同药物的对数浓度为横坐标，相应的细胞生长抑制率为纵坐标，求出直线回归方程，根据该方程计算出IC50。
2.4.2 改良寇氏法［7］
当细胞生长抑制率与药物浓度不存在对数关系时，采用寇氏法计算IC50。药物IC50值的公式为：IC50=lg-1［Xm-i (∑p-0.5)］。式中Xm：设计的最大浓度的对数值；i：相邻两组浓度对数值之差；∑p：各组生长抑制率之和；0.5：经验常数。
3 结果
3.1 不同浓度提取物对白血病细胞株L1210的抑制结果见表1。石油醚部位和醋酸乙酯部位对白血病细胞株L1210都有直接抑制作用，抑制率与提取物浓度成正比。细胞生长抑制率与药液浓度无对数关系，故采用寇氏法计算IC50，IC50分别为83.5 μg/ml和76.2 μg/ml。正丁醇部位和甲醇部位对白血病细胞株L1210基本无活性。表1 受试样品对白血病细胞株L1210抑制的影响(略)
3.2 不同浓度提取物对白血病细胞株P388D1的抑制结果见表2。石油醚部位和醋酸乙酯部位对白血病细胞株P388D1都有直接抑制作用，抑制率与提取物浓度成正比。细胞生长抑制率与药液浓度无对数关系，故采用寇氏法计算IC50。IC50分别为60.8 μg/ml和90.1 μg/ml。正丁醇部位和甲醇部位对白血病细胞株L1210无活性。表2 受试样品对白血病细胞株P388D1抑制的影响（略）
3.3 不同浓度提取物对宫颈癌细胞株Hela的抑制结果见表3。石油醚部位和醋酸乙酯部位对宫颈癌细胞株Hela都有直接抑制作用，抑制率与提取物浓度成正比。细胞生长抑制率与药液浓度存在对数关系，故以曲线回归法求IC50。IC50分别为39.5μg/ml和74.6 μg/ml。正丁醇部位和甲醇部位对宫颈癌细胞株Hela无活性。表3 受试样品对宫颈癌细胞株Hela抑制的影响（略）
3.4 不同浓度提取物对人胃癌细胞株SGC7901的抑制结果见表4。石油醚部位对人胃癌细胞株SGC7901有直接抑制作用，抑制率与提取物浓度成正比。细胞生长抑制率与药液浓度存在对数关系，故以曲线回归法求IC50，IC50为78.7 μg/ml。醋酸乙酯部位、正丁醇部位和甲醇部位对人胃癌细胞株SGC7901无活性。表4 受试样品对人胃癌细胞株SGC7901的抑制的影响（略）
3.5 不同浓度提取物对黑色素瘤细胞株B16的抑制结果如表5显示，醋酸乙酯部位对黑色素瘤细胞株B16有直接抑制作用，抑制率与提取物浓度成正比。细胞生长抑制率与药液浓度不成对数关系，故以寇式法求IC50，IC50为62.0 μg/ml。石油醚部位、正丁醇部位和甲醇部位对黑色素瘤细胞株B16无活性。
3.6 不同浓度提取物对神经肿瘤细胞株NG108-15的抑制结果如表6显示，石油醚部位和醋酸乙酯部位对神经肿瘤细胞株NG108-15都有直接抑制作用，抑制率与提取物浓度成正比。细胞生长抑制率与药液浓度成对数关系，故以曲线回归法求IC50，它们的的IC50分别为49.4 μg/ml和54.9 μg/ml。正丁醇部位和甲醇部位对神经肿瘤细胞株NG108-15基本无活性。表5 受试样品对黑色素瘤细胞株B16抑制的影响（略）
3.7 不同浓度提取物对人肝癌细胞株Hela7404的抑制结果见表7。石油醚部位和醋酸乙酯部位对人肝癌细胞株Hela7404都有直接抑制作用，抑制率与提取物浓度成正比。细胞生长抑制率与药液浓度均成对数关系，故以曲线回归法求IC50，IC50分别为78.9 μg/ml和41.5 μg/ml。正丁醇部位和甲醇部位对人肝癌细胞株Hela7404基本无活性。表6 受试样品对神经肿瘤细胞株NG108-15抑制的影响（略）表7 受试样品对人肝癌细胞株Hela7404抑制的影响（略）
4 讨论
体外实验抗肿瘤药物的筛选方法中，实验选择了四氮唑蓝法［MTT法］。1983年由Mosmann在免疫学研究中应用于鼠淋巴细胞系研究IL-2等细胞应用于对细胞存活和增效的影响，而建立MTT方法［8］，随后，Denizot和carmichael等进一步改进并获得更好的效果，使之运用于人类肿瘤细胞体外药敏试验［9,10］。
表1～7显示，青天葵石油醚部位在受试5个剂量（15，30，60，120，240 μg/ml）下对白血病细胞株L1210和P388D1、宫颈癌细胞株Hela、人胃癌细胞株SGC7901、神经肿瘤细胞株NG108-15、人肝癌细胞株Hela7404等6种瘤株都有直接抑制作用，抑制率与提取物浓度成正比，IC50分别83.5，60.8，39.5，78.7，49.4，78.9 μg/ml。青天葵醋酸乙酯部位在受试5个剂量（15，30，60，120，240 μg/ml）下对白血病细胞株L1210和P388D1、宫颈癌细胞株Hela、黑色素瘤细胞株B16、神经肿瘤细胞株NG108-15、人肝癌细胞株Hela7404等6种瘤株都有直接抑制作用，抑制率与提取物浓度成正比，IC50分别76.2，90.1，74.6，62.0，54.9，41.5 μg/ml。正丁醇部位和甲醇部位对7种肿瘤细胞都无明显直接抑制作用。
随着分子肿瘤学研究的不断深入，体外抗肿瘤实验已成为抗肿瘤药物研发过程中必不可少的一种方法。该方法具有经济、快速、高效的优点。目前最常用的体外抗肿瘤筛选方法为MTT法。实验中对青天葵石油醚、醋酸乙酯、正丁醇和甲醇部位，采用MTT法，选用7种肿瘤细胞株进行抑瘤实验，以期得到具有较高可信度的体外抗肿瘤活性的有效部位，同时为青天葵的进一步研究提供依据。
青天葵的体外实验结果表明，经过系统提取分离后，青天葵石油醚和醋酸乙酯部位具有明显的抑瘤作用。本实验为青天葵抗肿瘤有效成分的筛选及抗肿瘤作用机理研究，提供了一定的理论依据。但在体外实验中对癌细胞有抑制作用和杀伤作用的药物，在活体中由于各种综合因素的作用而不一定具有抗肿瘤作用。因此，还必须对青天葵石油醚和醋酸乙酯部位进行体内实验以验证其有抗肿瘤作用。
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