农柑菌转基因玉米的研究进展
农柑菌转基因玉米的研究进展
叶茂录
（园艺0903班 38号）
摘要 ：从转基因技术、 农杆菌介导的受体以及影响农杆菌转化的因素和玉米转基因的现状等方面， 综述了在玉米中农杆菌介导转基因的进展。
关键词： 玉米； 转基因； 农杆菌介导
玉米是重要的饲料、 工业原料和粮食作物， 在国民经济中占有非常重要的地位， 随着社会经济的发展， 全球的玉米需求量持续增长。转基因作物指将一种或几种植物、 动物乃至人类的基因导入某种作物， 使其基因重新组合， 增强其抗逆性、抗病虫害、抗杂草等优良性状。转基因玉米的研究与开发已取得了显著进展[1-4] 。许多外源基因已经被导入玉米， 以改良玉米的某些性状， 并取得了很好的成效。2 0世纪 8 0年代后期， 些研究者尝试用根癌农杆菌接种玉米幼苗。采用病毒感染以及外源 D N A与花粉混合授粉等方法， 试图将外源 D N A导 入到玉米中， 虽得到一些转化表现， 但均未得到分子生物学证据。F r o m m等用电激法把抗除草剂基因P a t 转入玉米原生质体中， 开创了玉米遗传转化研究的先河。R h o d e s 等用电激法把N p t I I 基因转入玉米原生质体中， 经过抗性筛选、 分化再生得到抗 K m的转基因植株。F r o m m、 G o r d o n ． k a m m等利用基因枪轰击原生质体获得可育的玉米转基因植株[5-7]. 农杆菌介导法是转基因技术中经常采用的一种手段。根癌农杆菌是许多双子叶植物肿瘤病的病原菌， 它含有 T i 质粒， 其中的T - D N A能够转移到植物基因组上。农杆菌在双子叶植物中的转化已经十分完善， 但是由于玉米等单子叶植物不是其天然的寄主， 所以转化工程比较困难。但最近几年的研究表明农杆菌可以介导玉米上的基因转化。
1 常用玉米转基因的方法
在现代育种技术中， 常用的转基因方法往往结合使用，以提高转基因的效果。明小天等通过基因枪提高了根癌农杆菌转化水稻的转化效率[8]。花粉管通道法既可以用普通的质粒， 也可用农杆菌 T i 质粒。另外， 还有 P E G介导法、 超声波法、子房注射法、 阳离子转化法和电击法等。
1 ． 1 基因枪法 1 9 8 9 年K l e i n 第 1 次使用基因枪介导法转化。P h i l i p p e 等用山梨糖醇和甘露醇处理 A 1 8 8×1 3 7 3的胫性悬浮细胞， 用基因枪把 G U S基因导入玉米， 结果表明经山梨糖醇和甘露醇处理过的细胞转化频率提高 2 ． 7～6 ． 8 倍 。基因枪法是玉米遗传转化的主要方法， 受体组织类型对基因枪法的转化有一定的影响。基因枪法具有不受基因型的限制、 受体广、 转化率高的优点， 但外源基因整合的拷贝数多[9]。
1 ． 2 花粉管通道法 花粉管通道法的主要原理是授粉后使外源基因沿花粉管渗入． 经过珠心通道进入胚囊， 转化尚不具备正常细胞壁的卵、 合子或早期胚胎细胞。花粉管通道法 始于 1 9 7 5年 P a n d e y对烟草的研究。H e s s报道了利用外源D N A花粉得到花色变异的矮牵牛。周光宇在分析远缘杂交成功经验的基础上， 提出了 D N A片段杂交假设，为花粉管通道法提供了理论基础[12] 。花粉管通道法无需建立愈伤组织等组织培养体系， 同时不受植株基因型的限制， 但由于授粉时间短， 使得不能转化大片段的外源D N A [10]。
1 ． 3 电击法 电击法是利用高压电脉冲对细胞“ 电击穿孑 L 形成可逆的瞬间通道 ， 促进外源 D N A的摄取。电击法可用于原生质体、 胚性悬浮细胞系、 愈伤组织、 幼胚等转化 ， 该方法操作简便 ， 但转化频率低。
2 . 根癌农杆菌介导玉米遗传转化
根癌农杆菌介导玉米遗传转化根癌农杆菌转化系统具有许多优点： 成功率高， 效果好， 外源基因整合位点较稳定， 且大多数是单位点整合； 显性表达率较高， 共抑制现象相对较少； 遗传稳定性好， 大多符合孟德尔遗传规律等。利用该方法转化植物的研究始于2 0世纪8 0 年代初。由于单子叶植物不是农杆菌天然受体， 所以遗传转化研究落后于双子叶植物[5]。B y t e i e r 用带有 N o s n p t I I 的T i 质粒转化刁石柏愈伤组织， 得到了抗 Km再生植株[11] 。
2 ． 1 农杆菌介导转化玉米的研究历程 付永彩将农杆菌介导禾本科作物转化的研究历程分为3大阶段[12] ， 所以农杆菌介导的玉米转基因研究也可分为3个阶段。证明农杆菌能够侵染玉米。G f i m s l e y等将带有 Ms v ( 玉米条斑病毒) 基因的胭脂碱型根癌农杆菌注入玉米幼苗， 发现 9 8 ％叶片出现感染 症状， 而条斑病毒与玉米单独共培养时不能感染， 说明可以通过农杆菌介导病毒进入玉米细胞。
第2 个阶段， 获得转化细胞( 组织) ， 但未能获得转基因植株。S h e n等用农杆菌与芽尖共培养、 T s h ig e用农杆菌转化胚性愈伤都得到了稳定的转化体系但未得到植株。
第3个阶段， 获得转基因植株， 并有分子杂交证据。 G ou l d 报道了农杆菌转化玉米茎尖分生组织获得成功。I s h i d a 等构建农杆菌超级双元载体转化体系， 使转化频率高达5 ％ ～3 0 ％， 并且用农杆菌浸染 A1 8 8的幼胚， 得到的转 B a r 、 G U S 植株 7 0 ％可育。E s c u d e r o 等用农杆菌浸染玉米幼胚， 发现不型的影响。同时期， 幼胚感染率不同， 而且发现T ． D N A的转移受到基因.
国内玉米农杆菌的转化研究起步较晚。1 9 9 9年黄璐、 卫志明首次用农杆菌介导法把 N p t I I 、 G U S 、 Hp t 基因转入玉米， 转化率为8 ．1 ％[13]。张荣等用农杆菌浸染玉米幼胚， 初步建立转化体系， 但未获得转化植株[14]
2 ． 2 农杆菌介导的转基因受体
2 ． 2 ． 1 原生质体 F m m m、 R h o d e 、 Wa n g等以玉米的原生质体为受体， 对玉米进行遗传转化[15-16] 。作为转化受体， 原生质体具有转化效率高、 嵌合体少、 适宜各种转化系统等优点， 但。 原生质体同时具有培养周期长、 再生频率低、 遗传稳定性差、 再生植株变异大等缺点。马力耕等以黄化叶片为材料， 通过2步酶解获得了原生质体[17]。文仁来等通过酶解以花药培养获得的单倍体愈伤组织， 得到的原生质体可用于体细胞杂交[18]。支那英等将小麦和玉米的原生质体进行杂交得到体细胞杂种[19]
2 ． 2 . 2 愈伤组织 外植体经过脱分化培养诱导出愈伤组织 ，再经过分化培养获得再生植株。至今除幼胚外， 已从幼穗 、 叶片 、 花药 、 胚叶等外植体诱导出愈伤组织并获得再生植株。但外植体不同，愈伤组织的诱导和再生能力也不同。 玉米幼胚具有强烈的分生状态 ， 容易诱导愈伤并且再生植株 ， 使用的也最多。 但玉米愈伤组织再生系统明显受基因型限制 ， B r o n s d e m a等的研究表明 ， 玉米愈伤组织再生系统中的基因型效应既存在核效应 ，也存在核质互作效应 。愈伤组织再生系统外植体取材广， 由受基因型限制 ，获得的再生株无性变异大 ，嵌合体多。
3 ． 1 抗虫基因 张艳贞等以玉米自交系 3 4 0 、 4 1 1 2为材料， 用带有p G B I L 0 4 质粒的根癌农杆菌L B A 4 4 0 4转化幼胚及其初始愈伤组织， 培养3 d ， 在P P r培养基上连续筛选3代， 获得了再生植株[20]。张艳贞等发现抗性植株平均发生率 1 1 ． 2 1 ％， 平均转化率 2 ． 3 5 ％， 降低温度至 2 2℃共培养， 转化率可达4 ． 4 4 ％， 部分转化植株已经结实[21]。权瑞党等利用农杆菌A G L n 侵染玉米胚性愈伤组织， 将雪花莲凝聚素基因转入玉米骨干自交系齐3 1 9和掖5 1 5中， 获得转基因植株[22]。伍晓丽等利用带质粒 p B U S C K - H y g 农杆菌 L B A 4 4 0 4 将豇豆胰蛋白酶抑制剂基因 C p l i 转入玉米 自交系 1 8 ． 5 9 9中， C p l i 对玉米螟、 粘虫、 玉米根叶甲等多种害虫具有广谱抗性。
3 ． 2 抗病毒 美洲商陆抗病毒蛋白( P A P ) 是从美洲商陆植 物体内提取出来的一种碱性蛋白， 属 I 型核糖体失活蛋白， 具有广谱抗病毒能力。它对 7个植物病毒属成员具有抑制作用， 并且对细菌、 真菌和 H I V有一定的抑制作用。孙晓丽等将 P A J ) 转入玉米， 得到了具有广谱抗性的玉米植株。
3 ． 3 抗盐 尹小燕等以玉米骨干自交系 D H 4 8 6 6 、 齐 3 1 9和鲁原 1 6 1 0 6 的胚性愈伤组织为材料， 采用农杆菌介导法将A t N H X1 和H p l 基因转入玉米培养细胞， 经筛选获得了抗潮霉素的愈伤组织和再生植株， 经P C R检测和 S o u t h e r n． b 1 0 l 验 证， 确定了2 2 ． 8 ％再生植株为转基因植株。农杆菌液浓度、 愈伤组织基因型及共培养时间对转化率均有明显影响。外源基因在转基因植株后代中的分离呈多样性， 在部分株系中表现出孟德尔遗传规律。耐盐筛选表明， 一些转基因植株及其后代具有很好的耐盐性， 部分株系可在0 ． 8 ％～1 ． 0 ％N a C I 溶液浇灌下萌发和生长。
3． 4 抗病转基因玉米
抗病转基因玉米的主要 目标是抗病毒和抗真菌病害。研究发 现玉米矮花叶病毒 ( MDMV) B株外壳蛋白在转基因植株 中表现 出对 MDMV的抗性。 另外 ， 转几丁质酶基因玉米被认 为具有抗真菌病害
的效果。
3 ． 5 改良品质
赖氨酸是玉米蛋 白质 中的限制性氨基酸 ， 含量高低直接关系到玉米的营养价值。孙学辉等[24]通过基因工程提高了玉米的赖氨酸含量。国外已经报道了通过转基 因玉米生产鸡蛋抗生素蛋 白，并已进入商业化生产。
4 影响农杆菌转化的因素 农杆菌介导遗传转化主要包括5个过程： ①农杆菌在植物细胞上的吸附； ②T i 质粒上的v i r 区被激活； ③T ． D N A切割与 T - D N A复合物的形成； ④T - D N A复合物进入植物细胞； ⑤T - D N A整合到植物染色体上。 农杆菌介导遗传转化关键在于农杆菌能否在植物细胞上吸附， V i r 区基因是否被诱导， 植物感受态细胞是否存在。
5 小结
农杆菌介导的遗传转化过程是自然界发生的完美的基因转化过程。农杆菌的一段 D N A( T - D N A) 能插入到受体植物细胞基因组， 并能稳定地遗传给后代。作为一种天然的植物基因转化系统， 农杆菌介导的遗传转化过程具有转化的外源D N A结构完整， 转化机理清楚， 整合位点稳定， 拷贝数低， 聚合后的外源基因结构变异较小等优点。将 D N A直接通过T i 质粒介导转入完整细胞的转化方法转化频率比较高， 再生植株可育性比较高， 可以转移大片段外源 D N A。因此， 随着研究的不断深入， 农杆菌介导有可能成为玉米转基因的主要导入方法。
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