α2酮酸配伍低蛋白饮食对糖尿病大鼠肾脏肥大的影响及其与肾小球周期素激酶抑制剂p27的关系
? 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
作者单位 :200433 上海 , 第二军医大学长海医院肾内科
·专题研究·
α2酮酸配伍低蛋白饮食对糖尿病大鼠
肾脏肥大的影响及其与肾小球
周期素激酶抑制剂 p27 的关系
梅小斌 袁伟杰 张小瑛 郭志勇 许静 崔若兰 李保春 于建平
【摘要】 目的 探讨α2酮酸配伍低蛋白饮食对糖尿病大鼠肾脏肥大的影响及其与肾小球周期素激酶抑制
剂 p27 的关系。方法 腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病 (DM) 模型 ,分别予正常蛋白 (蛋白占饲料重量的 10 % ,
NPD 组) 、低蛋白 (蛋白占饲料重量的 5 % ,L PD 组) 、α2酮酸 + 低蛋白 (蛋白占饲料重量的 5 % ,其中α2酮酸提供
1 %的蛋白 , L PD +α2KA 组) 饮食治疗 8 周。蛋白印迹 (Western 杂交) 方法测定肾小球裂解液 p27 蛋白水平 ,
EL ISA 方法测定肾小球裂解液细胞外基质 ( ECM) 蛋白 ( Ⅳ型胶原及纤维连接蛋白) 和尿白蛋白 ,采用图像分析系
统测定肾小球面积。结果 各组 DM 大鼠肾小球 p27 水平及 ECM 蛋白水平均增高 ,尿白蛋白排泄增多 ,肾重/
体重比例增高 ,肾小球面积增大 ,但 L PD 组及 L PD +α2KA 组大鼠的变化较 NPD 组轻。L PD +α2KA 组肾小球
p27 水平 (8. 6 ±2. 3) 较 L PD 组 (11. 1 ±3. 6) 显著降低 ( P < 0. 01) ,ECM 蛋白水平进一步下降 ,尿白蛋白排泄减少
更明显 ( P < 0. 01 ) ,DM 大鼠肾重/ 体重比例下降更显著 ( P < 0. 05) ,肾小球面积进一步减少 ( P < 0. 05) 。DM 大
鼠肾小球 p27 水平与肾重/ 体重比例呈直线相关。L PD 组、L PD +α2KA 组和 NPD 组间的血糖水平及血白蛋白
水平差异无显著性。结论 α2酮酸配伍低蛋白饮食可能通过降低肾小球 p27 水平并在低蛋白饮食的基础上进
一步抑制糖尿病肾脏肥大 ,从而改善糖尿病肾病。
【关键词】 低蛋白饮食 ;α2酮酸 ;细胞周期调节蛋白 ;周期素激酶抑制剂 ;糖尿病肾病
Experiment on effects of low2protein diet supplemented withα2ketoacids on hypertrophy of diabetic glomerulus and
its relationship with the level of cyclin kinase inhibitor p27 M EI Xiaobin , YUA N Weijie , ZHA N G Xiaoying , et
al. Department of Nephrology , Changhai Hospital , The Second Military Medical University , S hanghai
200433 , China
【Abstract】 Objective To investigate the relationship between the cyclin kinase inhibitor p27 and the effect of
low2protein diet supplemented withα2keto acids on hypertrophy of diabetic glomerulus in rats. Methods STZ2induced
diabetic rats were given low2protein diet (5 %protein in fodder)or low2protein diet supplemented withα2keto acids (5 %
protein in fodder including 1 % protein supplied byα2keto acids ) or normal2protein diet (10 %protein in fodder ) for 8
weeks. The p27 protein of glomerular lysate was detected with Western Blot. The extracellular matrix ( ECM) protein
(type Ⅳcollagen and fibronectin) of glomerular lysate and 24 h urine albumin were examined with EL ISA. Image
analysis system was used to detect the diameter of each glomerulus. Results Glomerular p27 protein increased in dia2
betic rats no matter what kinds of diet were given. Meanwhile , the 24 h urine albumin , glomerular ECM , glomerular
diameter elevated as well as the ratio of kidney weight over body weight in diabetic rats. Both low2protein diet and low2
protein diet supplemented withα2keto acids could attenuate changes occurred in diabetic rats with normal2protein diet.
Glomerular p27 level (8. 6 ±2. 3 vs 11. 1 ±3. 6 , P < 0. 01) ,24 h urine albumin , (13. 21 ±2. 49 ) μg/ 24 h vs (18. 13
±3. 23 )μg/ 24 h , P < 0. 01 ,glomerular diameter ,(652 ±73)μm2 vs (721 ±75)μm2 , P < 0. 05 , and the ratio of kid2
ney weight over body weight (11. 02 ±1. 72 vs 12. 03 ±1. 85 , P < 0. 05) were lower in diabetic rats with low2protein
diet supplemented withα2keto acids than diabetic rats with low2protein diet. Solely glomerular p27 level was linearly
related with the ratio of kidney weight over body weight in diabetic rats. The blood glucose and serum albumin re2
mained constant in diabetic rats no matter what kinds of diet were given. Conclusion Low2protein diet supplemented
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withα2keto acids can further inhibit glomerular hypertrophy ,and may protect diabetic glomerulus through decrease of
glomerular p27 level. (Shanghai Med J , 2002 ,25∶6832686)
【 Key words】 Low2protein diet ; α2keto acids ; Cell cycle regulatory protein ; Cyclin kinase inhibitor ; Diabetic
nephropathy
周期素激酶抑制剂 p27 在高糖培养系膜细胞
肥大及糖尿病 (DM) 肾小球细胞肥大中起重要作
用[124 ] 。低蛋白饮食(low2protein diet ,L PD) 及α2酮
酸配伍 L PD (L PD +α2KA) 对糖尿病肾病 (DN) 有
保护作用 ,可减轻肾小球细胞肥大程度 ,减少尿蛋
白[5213 ] 。目前 ,关于 L PD +α2KA 能否比 L PD 更好
地改善 DN ,及 L PD +α2KA 是否通过影响肾小球
p27 蛋白水平来改善 DN 尚不清楚。本研究通过
观察 L PD +α2KA 改善 DN 的情况 ,并在 p27 水平
探讨 L PD +α2KA 治疗 DN 的作用机制。
材料和方法
一、DM 大鼠模型制备
选择 3 月龄雄性 SD 大鼠 ,重量 180～200 g ,
腹腔注射链脲佐菌素 (STZ) ( Sigma 公司 ,65 mg/
kg ,溶于 pH 4. 5 柠檬酸缓冲液中) ,于注药后 48 h
测血糖(氧化酶法 ,One touch Ⅱ血糖仪测定) ,血糖
超过 13. 8 mmol/ L 作为 DM 大鼠。分为 L PD 组 6
只 ,予 L PD(蛋白占饲料重量的 5 %) ;L PD +α2KA
组 6 只 ,予α2酮酸配伍低蛋白饮食 (蛋白占饲料重
量的 5 % ,其中α2酮酸提供 1 %的蛋白) ;正常蛋白
(NPD) 组 6 只 ,予正常蛋白饮食 (蛋白占饲料重量
的 10 %) 。正常对照组 6 只 ,予正常蛋白饮食 (蛋
白占饲料重量的 10 %) 。L PD 组及 L PD +α2KA组
大鼠饲料中加入淀粉 ,使饲料热量与 NPD 组相同
(16. 7 MJ/ kg 饲料) 。8 周后 ,处死各组大鼠。称
量大鼠体重和双侧肾重 ,制备肾小球裂解液。实验
期间大鼠自由饮水。
二、蛋白印迹(Western 杂交)
处死大鼠 ,分离肾皮质 ,先后碾磨并通过 100、
150、200 目筛网 ,收集 200 目筛网上物质 ,得肾小
球悬液 ;4 ℃、4 000 r/ min 离心肾小球悬液 ,沉淀物
为肾小球。加入三去污剂裂解缓冲液 (0. 2 %叠氮
钠 ,1 %十二烷基硫酸钠 ,100 μg/ ml 苯甲基磺酰
氟 ,1 μg/ ml 抑蛋白酶肽 ,1 %Nonidet P240 ,5 %去
氧胆酸钠等) 裂解肾小球。4 ℃、14 000 r/ min 离
心 ,采用改良 Lowry 法测定上清液蛋白浓度 ;用三
去污剂裂解缓冲液将每个样本的蛋白浓度调整至
80μg/ 15 μl , 15 %十二烷基硫酸钠2聚丙烯酰胺
(SDS2PAGE) 凝胶电泳后电转移至硝酸纤维素膜
上 ;5 %脱脂牛奶封闭硝酸纤维素膜 1 h ,洗膜后加
入小鼠 p27 单克隆抗体(1 ∶500稀释 ,Santa Cruz 公
司) 杂交 1 h ,再度洗膜后加辣根过氧化物酶标记的
羊抗小鼠多抗(1∶500 稀释 ,华美生物用品公司) 杂
交 1 h ;洗膜后加 ECL (增强化学发光) 试剂 (上海
吉泰科技公司) ,然后将硝酸纤维素膜放入 X 光片
暗盒 ,压片 ,显影 ,定影。利用复日图像分析系统扫
描确定 X 光片上杂交条带的相对吸光度值 (对照
组大鼠肾小球裂解液的 p27 吸光度值为相对值
1) 。
肾小球裂解液 Ⅳ型胶原 EL ISA 测定试剂盒为
上海施高公司产品 ,纤维连接蛋白 ( Fn) EL ISA 测
定试剂盒为上海太阳生物技术公司产品 ,尿白蛋白
EL ISA 测定试剂盒为上海德波生物技术公司产
品 ,按说明书进行操作。
用彩色病理图像分析系统 (上海交通大学研
制) 测定肾小球面积(放大 100 倍时进行) 。
三、统计学处理
所有数据均用均数 ±标准差表示 ;组间数据比
较采用方差分析。
结 果
一、L PD +α2KA 对 DM 大鼠 24 h 尿白蛋白、
血糖及白蛋白的影响
与正常对照组相比 ,NPD 大鼠尿白蛋白排泄
显著增加 ,血糖及血白蛋白无明显变化。L PD 组
及 L PD +α2KA 组的尿白蛋白排泄减少 ,以 L PD +
α2KA 组最明显。L PD 组、L PD +α2KA 组与 NPD
组间血糖、白蛋白差异无显著性 ,见表 1。
表 1 8 周后各组大鼠 24 h 尿白蛋白、血糖、血白蛋白
组别 24 h 尿白蛋白(μg) 血糖(mmol/ L) 白蛋白(g/ L)
正常对照组 3. 42 ±0. 36 4. 8 ±1. 2 37. 5 ±3. 6
NPD 组 40. 18 ±3. 79 ① 23. 8 ±4. 3 36. 8 ±3. 9
L PD 组 18. 13 ±3. 23 ② 23. 3 ±3. 5 37. 2 ±3. 5
L PD +α2KA 组 13. 21 ±2. 49 ③ 22. 9 ±3. 6 38. 1 ±2. 7
与正常对照组相比 : ①P < 0. 01 ;与 NPD 组相比 : ②P < 0. 01 ;与
L PD 组相比 : ③P < 0. 01
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表 2 8周后各组大鼠肾重/ 体重、肾小球面积、肾小球 ECM 蛋白
组别 肾重/ 体重(10 - 3) 肾小球面积(μm2) Fn(pg/ mg 蛋白) Ⅵ型胶原(pg/ mg 蛋白)
正常对照组 7. 92 ±1. 23 421 ±53 2. 6 ±1. 0 17. 4 ±4. 3
NPD 组 15. 62 ±2. 13 ① 815 ±97 ① 17. 1 ±3. 9 ① 150. 6 ±47. 1 ①
L PD 组 12. 03 ±1. 85 ② 721 ±75 ② 9. 8 ±2. 9 ② 99. 6 ±25. 3 ②
L PD +α2KA 组 11. 02 ±1. 72 ③ 652 ±73 ③ 7. 3 ±2. 6 ③ 87. 2 ±24. 2 ③
与正常对照组相比 : ①P < 0. 01 ;与 NPD 组相比 : ②P < 0. 01 ;与 L PD 组相比 : ③P < 0. 05
二、L PD +α2KA 对 DM 大鼠肾重/ 体重、肾小
球面积及细胞外基质( ECM) 蛋白的影响
NPD 组的肾重/ 体重比例上升 ,肾小球面积增
加 ,肾小球裂解液 Fn 及 Ⅵ型胶原显著增多。L PD
组及 L PD +α2KA 组的上述变化程度减轻 ,以 L PD
+α2KA 组最显著。见表 2。
三、L PD +α2KA 对 DM 大鼠肾小球 p27 水平
的影响
8 周后 , NPD 组的肾小球 p27 水平为 19. 6
±5. 1 ,较正常对照组的 1. 0 ±0. 3 明显增高 ( P <
0. 01) ;L PD 组的肾小球 p27 水平下降 ,为 11. 1
±3. 6 ,与 NPD 组相比 ,差异有显著性 ( P < 0. 01) ;
L PD +α2KA 组的肾小球 p27 水平下降更明显 ,为
8.6 ±2. 3 ,与 L PD 组相比 ,差异有显著性 ( P <
0. 01) ,见图 1。
图 1 L PD +α2KA 对 DM 大鼠肾小球 p27 水平的影响
四、p27 水平与肾脏肥大的相关性
直线相关分析显示 ,p27 与 DM 大鼠肾脏肥大
指数肾重/ 体重呈正相关( r = 0. 95 , P < 0. 05) 。
讨 论
细胞周期调节蛋白 (cell cycle regulatory pro2
tein ,CCRP) 可决定细胞是否增生肥大[14 ] 。p27 是
一种十分重要的负性 CCRP ,其主要生物效能为抑
制细胞周期的运转 ,过度抑制则使细胞肥大。研究
证实 ,p27 水平增高在高糖培养系膜细胞肥大及
DM 肾小球体积增大中起重要作用[1 ,3 ,14 ,15 ] 。有文
献报道 , L PD 及 L PD +α2KA 可保护 DN 的肾功
能[5213 ] 。但目前尚不明确 L PD +α2KA 对 DM 大鼠
肾脏肥大程度的影响力及其是否通过降低 DM 肾
小球 p27 蛋白水平而减轻肾小球细胞肥大 ,减少蛋
白尿 ,从而改善 DN 。
本研究发现 ,NPD 组肾重/ 体重比例上升 ,肾
小球面积增大 ,肾小球 ECM 蛋白水平增高 ,尿白
蛋白排泄增加 , L PD 及 L PD +α2KA 均可使 DM 大
鼠的上述变化减轻。与 L PD 组相比 ,L PD +α2KA
组的肾重/ 体重比例及肾小球面积进一步下降 ,肾
小球 ECM 蛋白水平进一步降低 ,尿白蛋白排泄量
减少更明显 ,提示 L PD +α2KA 在 L PD 基础上可进
一步减轻肾脏肥大程度 ,从而改善 DN 病变。高蛋
白摄入后肾小球内前列腺素 E2 、前列腺素 Flα、胰升
糖素、一氧化氮合成分泌增加 ,而α2KA + L PD 可
以缓解上述改变 ;L PD 常可随着磷摄入的减少 ,而
减少肾小管和间质的钙、磷沉积 ;因此 L PD +α2KA
可以减轻肾小球的高滤过及高灌注、减轻肾小管及
间质的损害[10 ] 。血白蛋白浓度正常提示 L PD +α2
KA 及 L PD 组大鼠无营养不良发生 ,这与 L PD +α2
KA 及 L PD 降低尿蛋白排泄及改善胰岛素的敏感
性有关[16 ,17 ] 。
NPD 组 p27 水平增高 ,同时肾重/ 体重比例上
升 ,肾小球面积增加 ,且肾小球 p27 水平与肾重/ 体
重呈正相关 ,通过细胞学研究及对动物模型的探讨
提示 ,p27 水平增高在正常蛋白饮食 DM 大鼠肾小
球肥 大 中 起 重 要 作 用[1 ,3 ,4 ,15 ] 。L PD +α2KA 和
L PD 均能降低 DM 大鼠的肾小球 p27 水平 ,同时
改善 DN ;与 L PD 组相比 ,L PD +α2KA 组肾小球
p27 水平下降更明显 ,而肾小球肥大程度进一步减
轻 ,提示 L PD +α2KA 可通过降低肾小球 p27 水平
减轻 DM 大鼠肾脏肥大程度 ,从而保护糖尿病肾
功能。L PD +α2KA 降低 p27 的机制目前尚不明
确 ,有报道认为高蛋白饮食可增加血浆肾素活性 ,
L PD +α2KA 可降低肾素活性 ,并控制肾素2血管紧
张素2醛固酮系统的异常代谢 ;血管紧张素 Ⅱ(Ang
Ⅱ) 可提高高糖培养系膜细胞中 p27 蛋白水平 ,从
而诱导系膜细胞肥大[7 ,18 ] 。因此推测 ,L PD +α2
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KA 可能通过降低 Ang Ⅱ起作用 ,从而降低 DM 时
肾小球 p27 蛋白水平。
总之 ,L PD +α2KA 可在 L PD 的基础上进一步
降低 DM 大鼠的肾小球 p27 水平 ,减轻肾脏肥大程
度 ,减少尿白蛋白排泄 ,从而进一步改善 DN 。
参 考 文 献
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(收稿日期 :2002209217)
(本文编辑 :王小燕)
·消息·
中华医学会第八届全国实验外科学术会议征文通知
为展示我国实验外科近年来的新进展、新成果 ,中华医学会外科学分会实验外科学组、辽南地区胃癌协作组定于 2003
年 4 月在大连召开中华医学会第八届全国实验外科学术会议。本次会议将邀请外科学界院士和知名专家作专题演讲。凡
参会者均颁发中华医学会继续教育学分证书。现将征集论文的有关事宜通知如下 :
1. 征文内容 : (1) 外科新技术、新理论 ; (2) 肝、胆、胰、胃肠外科等领域的基础研究和实验研究 ; (3) 外科肿瘤的研究进
展 ; (4) 分子生物学、生物工程、纳米医学在外科的应用 ; (5) 实验动物学在外科的应用 ; (6) 外科基本问题探讨及实验研究。
2. 征文要求 : (1) 论文请寄全文及 800 字以内的摘要各一份 (自留底稿) ,摘要应包括文题 ,作者单位 ,邮编 ,姓名及论文
目的、方法、结果、结论等 ,无摘要者恕不受理。(2) 论文要求科学性强、数据可靠、重点突出、文字精练 ,须由作者所在单位
审查盖章同意 ,并请在信封正面注明会议征文字样 ; (3) 本次会议亦欢迎在基层医院临床一线工作的外科医师踊跃投稿 ,介
绍解决临床疑难问题的工作经验 ; (4) 征文截稿日期 :2002 年 12 月 30 日 ; (5) 来稿请寄 :大连医科大学附属第一医院普外
科胡祥主任收。邮编 :116011。电话 041123635963 转 3082、2072、2076。
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