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硕士论文-人胰岛素基因鸡输卵管特异表达载体的构建及转基因鸡的建立，共59页，30543字
摘 要
利用转基因动物生产功能性蛋白是目前生命科学领域中的研究热点，与哺乳动物乳
腺生物反应器相比，鸡输卵管生物反应器具有明显的优点。胰岛素是胰脏中胰岛β细胞
分泌的一种蛋白质激素，是维持血糖在正常水平的主要激素之一，也是治疗Ⅰ型糖尿病
的首选药物。
本实验首先从鸡胸肌中提取基因组 DNA，根据已报道的鸡卵清蛋白基因 5’调控序
列设计特异性引物，利用 PCR 的方法扩增获得了 1.2kb DNA 片段，克隆到 pGEM T-Vector
后，经酶切和序列测定证实，此片段即为鸡卵清蛋白基因 5’调控序列。分析发现，该
片段除具有真核启动子结构特征外，还保留了全部组织特异性表达所需的调控元件。
随后将此 1.2kb 的 DNA 片段克隆到真核表达载体 pVAX1 上，替换原有的 CMV 启动
子，再将含有第一内含子的经过改造的人胰岛素基因组基因连接到其下游，经酶切及测
序鉴定证明，我们成功地构建了人胰岛素基因输卵管定位表达载体 pOV-ImINS。
选取相同日龄海兰褐母鸡 8 只，通过卵巢注射法将上述输卵管特异性表达载体注射
入这些母鸡卵巢中，将其与正常公鸡合笼后，收集每只母鸡所产蛋，对所采集的鸡蛋
40 枚进行孵化，共获得 G1 代子鸡 21 只。用所设计的一对 PCR 引物 P1P2，扩增约 800bp
的胰岛素基因片段进行检测，结果共有 11 只为阳性，阳性率为 52.3%。为建立人胰岛
素转基因鸡生物反应器奠定了基础。
表达水平的检测及传代稳定性试验正在进行中。
关键词：人胰岛素
转基因鸡
卵清蛋白 5’调控区
目 录
摘 要 .. Ⅰ
ABSTRACT ....... Ⅱ
英文缩写词表.. Ⅲ
前言. 1
1.转基因鸡生物反应器... 1
1.1 鸡生物反应器的意义 3
1.2 鸡的胚胎发育及生殖生理特点............ 7
1.3 转基因鸡的制备方法 ............. 9
1.4 转基因鸡的作用...... 15
1.5 转基因鸡的检测方法............ 16
1.6 禽类转基因研究存在的问题 18
2.人胰岛素....... 19
2.1 胰岛素基因的分子生物学.... 19
2.2 胰岛素基因的作用及体内合成.......... 19
2.3 胰岛素与糖尿病...... 20
2.4 药用胰岛素的生产现状........ 20
试 验 部 分..... 22
1.鸡卵清蛋白 5’调控序列的克隆和鉴定 22
1.1 材料与方法 22
1.1 材 料........ 22
1.2 方 法 ......... 24
2. 结 果.......... 27
2.1 卵清蛋白 5 调控序列的扩增和测序结果 ...... 27
2.2 P-OV 载体的酶切鉴定.......... 27
2.3 测 序 结 果 ............ 28
3. 讨 论.......... 30
2．人胰岛素基因输卵管定位表达载体的构建.... 32
1. 材料和方法 . 32
1.1 材 料 ......... 32
1.2 方 法 ......... 32
2. 结 果.......... 34
2.1 重组载体 POV–PVAX1 的鉴定......... 34
2.2 重组载体 POV-IMINS 的鉴定........... 35
3. 讨 论 ........... 36
3．转基因鸡的制备...... 38
1．材料与方法 38
1.1 材 料 .......... 38
1.2 方 法 .......... 38
2. 结 果.......... 40
3. 讨 论.......... 40
3.1 阳性个体的筛选 ..... 40
3.2 纯合体转基因动物 . 41
3.3 转基因表达检测...... 41
结 论 42
参考文献.......... 43
致 谢 48
导师组意见...... 49
学位论文独创性声明及学位论文版权使用授权书............ 50