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  • 资源分类:生物农医
  • 适用专业:预防兽医学
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资料简介
硕士论文-鹅细小病毒NS1基因植物真核表达载体的构建及向苜蓿中的转化,共82页,51089字
摘 要
小鹅瘟(Goose plague,GP)是由鹅细小病毒(Goose parvovirus, GPV)引起的一
种主要侵害 4~10 日龄雏鹅的急性或亚急性败血性传染病,是危害养鹅业最严重的传染
病之一。GPV 属细小病毒科(Parvoviridae)、细小病毒属(Parvovirus)成员。含有两
个开放阅读框,左侧阅读框编码非结构蛋白 NS1、NS2,右侧阅读框编码结构蛋白 VP1、
VP2 及 VP3。其中 NS1 在病毒毒性、病毒复制及调节基因的表达方面发挥了重要的作用。
试验通过对鹅细小病毒非结构蛋白 NS1 基因转化苜蓿的探索,研究植物转基因技术在表
达鹅细小病毒抗原中的应用,为进一步研究鹅细小病毒 NS1 蛋白的生物学特性、揭示鹅
细小病毒致病机理及研制口服疫苗提供科学依据。
根据 Genebank 上发表的 GPV B 株基因组核苷酸序列设计一对特异性引物,PCR 扩增
出鹅细小病毒非结构蛋白 NS1 全长基因,约 2022bp,将其克隆到含有 CaMV35S 启动子的
植物表达载体 pBI121 中,转化大肠杆菌 JM109 感受态细胞,构建了植物表达载体 pBI121
-NS1,利用改进的热激法将其导入农杆菌 LBA4404,构建 NS1 植物双元表达载体,建立
了农杆菌介导法转化苜蓿的载体系统。
选用紫花苜蓿“金皇后”2~5 天的子叶、下胚轴和 15 天左右的幼嫩叶片为材料,
诱导筛选出良好的胚性愈伤组织,以该愈伤组织为受体,通过叶盘转化法将 GPV 的 NS1
基因转化苜蓿,卡那霉素抗性筛选后,获得抗性植株 52 株。提取抗性植株叶片基因组
DNA 做 PCR 特异性扩增,扩增出了 2022bp 的目的片断,获得了 6 株 PCR 阳性植株,抗性
植株的转化效率为 11.5%,表明目的基因 NS1 已经整合到转基因苜蓿的基因组中。提取
转基因苜蓿 RNA,RT-PCR 检测,结果显示,NS1 基因在转基因苜蓿的转录水平表达。
本研究探索了苜蓿作为生物反应器在生产鹅细小病毒非结构蛋白 NS1 上的应用,为
进一步研制鹅细小病毒可食化疫苗建立了牢固的理论基础,在预防和控制鹅细小病毒感
染,促进畜牧业发展中具有重要的科学意义和经济价值。
关键词:鹅细小病毒;NS1 基因;植物表达载体 pBI121;农杆菌 LBA4404;紫花苜
蓿;转基因
目录
摘要..........Ⅰ
Abstract.......Ⅱ
缩略词表......Ⅳ
前言...........1
1 鹅细小病毒研究进展.........1
1.1 鹅细小病毒研究历史.......1
1.2 鹅细小病毒的结构特征.....2
1.3 鹅细小病毒的理化特征.....2
1.4 鹅细小病毒的基因组特征...3
1.4.1 开放阅读框及编码区......4
1.4.2 末端回文结构............5
1.4.3 GPV 的转录与复制........6
1.5 鹅细小病毒的蛋白质特征...7
1.5.1 GPV 的结构蛋白..........7
1.5.2 GPV 的非结构蛋白........9
1.6 鹅细小病毒与其它细小病毒的关系.........11
1.7 鹅细小病毒病的分离鉴定及防治...........12
1.7.1 GP 的发病特征..........12
1.7.2 GPV 的分离和鉴定.......13
1.7.3 GPV 的防治.............13
2 转基因植物生产外源蛋白研究进展..........14
2.1 转基因植物生产外源蛋白的研究现状......14
2.2 转基因植物生产外源蛋白的潜在优势......17
2.3 转基因植物生产外源蛋白的研制原理及表达系统..........18
2.4 转基因植物生产外源蛋白存在的问题和讨论19
2.5 农杆菌介导的植物遗传转化体系及苜蓿植物遗产转化系统..19
2.6 本研究的目的与意义......22
研究内容......24
1 鹅细小病毒非结构蛋白 NS1 基因植物真核双元表达载体的构建 .............24
1.1 试验材料和方法..........24
1.1.1 病毒、菌种与质粒......24
1.1.2 引物....24
1.1.3 酶、主要试剂、培养基及仪器............24
1.1.4 GPV 核酸的提取及 DNA 定量.............26
1.1.4.1 GPV 病毒培养.........26
1.1.4.2 GPV 核酸的提取.......27
1.1.4.3 DNA 定量.............27
1.1.5 PCR 扩增目的 DNA 片断 NS127
1.1.6 蛋白酶 K 消化 PCR 产物...27
1.1.7 琼脂糖凝胶电泳和 DNA 片断的纯化回收..28
1.1.7.1 琼脂糖凝胶电泳.......28
1.1.7.2 DNA 片断的纯化回收...28
1.1.8 pBI121 质粒载体的提取..28
1.1.8.1 菌株的活化...........28
1.1.8.2 pBI121 质粒载体的提取29
1.1.9 目的片断与载体的酶切和连接...........29
1.1.9.1 目的片断的酶切.......29
1.1.9.2 载体 pBI121 的酶切....29
1.1.9.3 连接反应.............30
1.1.10 连接产物转化大肠杆菌 JM109..........30
1.1.10.1 大肠杆菌感受态细胞的制备..........30
1.1.10.2 连接产物转化大肠杆菌31
1.1.11 转化大肠杆菌的鉴定...31
1.1.11.1 菌液 PCR............31
1.1.11.2 质粒提取及琼脂糖电泳鉴定..........31
1.1.11.3 酶切鉴定............32
1.1.11.4 质粒的 PCR 鉴定......32
1.1.12 植物重组表达载体 pBI121-NS1 转化农杆菌 LBA4404....32
1.1.12.1 根癌农杆菌 LBA4404 感受态细胞的制备33
1.1.12.2 重组质粒转化根癌农杆菌 LBA4404....33
1.1.13 转化农杆菌的鉴定..... 33
1.1.13.1 菌液 PCR 鉴定........33
1.1.13.2 提取农杆菌 LBA4404 中的重组质粒....34
1.1.13.3 PCR 扩增检测重组质粒34
1.2 试验结果分析............34
1.2.1 鹅细小病毒的增殖......34
1.2.2 鹅细小病毒核酸的提取及目的基因的克隆.34
1.2.3 植物中间表达载体的提取及双酶切.......35
1.2.4 转化大肠杆菌阳性重组子的鉴定.........36
1.2.5 转化农杆菌阳性重组子的鉴定...........38
1.3 讨论......39
1.4 结论......44
2 鹅细小病毒 NS1 基因农杆菌介导法转化苜蓿的研究..........45
2.1 试验材料和方法..........45
2.1.1 农杆菌菌株及植物材料...45
2.1.2 主要试剂及培养基.......46
2.1.3 苜蓿无菌苗的培养.......46
2.1.4 外植体的准备...........46
2.1.5 外植体预培养...........46
2.1.6 农杆菌侵染用菌液的制备.47
2.1.7 农杆菌侵染及共培养.....47
2.1.8 洗叶.....47
2.1.9 愈伤组织的诱导培养.....47
2.1.10 诱导生根48
2.1.11 再生植株的筛选和移栽..48
2.1.12 转化植株的检测........48
2.1.12.1 转基因苜蓿植株 DNA 的提取..........48
2.1.12.2 转基因苜蓿植株 RNA 的提取..........49
2.1.12.3 转基因苜蓿的 PCR 检测49
2.1.12.4 转基因苜蓿的 RT-PCR 检测..........49
2.2 试验结果分析............50
2.2.1 转基因苜蓿的 PCR 检测...50
2.2.2 转基因苜蓿的 RT-PCR 检测.............51
2.3 讨论......52
2.4 结论......55
参考文献......57
附录 .........64
致谢..........65
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