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  • 资源类别:论文
  • 资源分类:生物农医
  • 适用专业:植物病理学
  • 适用年级:大学
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资料简介
硕士论文-天花粉蛋白突变基因TCSA-S在烟草中的表达、定位及抗性鉴定,共71页,39989字
摘 要
天花粉蛋白( Trichosanthin, TCS)属于Ⅰ型植物核糖体失活蛋白( Ribosome
Inactivating Protein,RIP),主要从药用植物栝楼(Trichosanthes kirilowii)的块根和叶中
提取出来,是一种抗滤过性病原体的植物防御蛋白。本研究应用转基因技术,以普通烟
草品种 K326 和三生烟为外植体,将栝楼天花粉蛋白的突变基因 TCSA-S 与 Gus 基因融合,
通过根癌农杆菌介导转化烟草,获得了含有目标基因插入序列的烟草转化体,通过分子
生物学验证、细胞学检测以及抗病性试验,研究 TCS 基因的氨基酸序列、结构、功能及
其抗病性机制。主要研究结果如下:
1、采用叶盘法,通过根癌农杆菌介导将含有 TCSA-S 基因的双元载体 pCambia
1301/3132-1 转化烟草,在 25mg/L 潮霉素的筛选条件下,K326 和三生烟的转化率分别
达到 55.9 %和 72.4 %,不含有 TCSA-S基因的空白载体 pCambia 1301 的转化率达到 75.2%。
2、根据突变基因 TCSA-S 基因序列设计特异引物,对 12 株烟草转化体进行 PCR 扩
增,获得含有目标序列、长度为 819bp 的扩增片段。转化载体 DNA 和扩增产物 DNA
测序表明,插入基因的核苷酸序列没有发生碱基的改变。X-gluc 的组织化学法染色,均
能检测到 Gus 基因在转基因植株的根、茎、叶中的表达。表明 TCSA-S 与 Gus 融合基因
已成功转入烟草的基因组中,其编码蛋白 116 和 161 位点的突变并不影响基因整合和表
达。
3、对 Gus 染色组织进行石蜡切片,镜检结果表明,含有 TCSA-S 基因的 pCambia
1301/3132-1 转化植株中,TCSA-S 与 Gus 基因的融合蛋白主要在叶片组织中的气孔、皮
层的薄壁细胞及表皮毛顶端获得表达。表明烟草转化体中突变基因 TCSA-S 的表达产物具
有一定的细胞特异性,其编码蛋白的前导序列对于蛋白产物在细胞中的分布具有一定的
影响。
4、病毒接种试验结果表明,含有 TCSA-S 基因的 pCambia 1301/3132-1 烟草转化植
株、不含有 TCSA-S 基因的 pCambia 1301 烟草转化植株以及对照 K326 植株,在接种 ToMV
和 CMV 以后,均表现出系统花叶的感病症状。接种植株的 SDS-PAGE 电泳显示,感病
植株能够分离出 ToMV 和 CMV 的外壳蛋白。因此,TCS 基因编码蛋白 116 和 161 位点
氨基酸的突变,导致烟草转化植株失去了对病毒 ToMV 和 CMV 的抗病性――说明 TCS
蛋白 116 和 161 位点的氨基酸涉及该蛋白对病毒的特异抗性。
关键词:天花粉蛋白;突变基因;转化;转基因烟草;抗病性
目 录
中文摘要…………..…...……….1
英文摘要………..……...……….2
缩略符号………..……...…….…4
前言………..……...…….…6
第一章、文献综述………………..…7
1 天花粉蛋白基因研究进展…………….…….……… 7
1.1 天花粉蛋白基因在医学上的应用研究…8
1.1.1 在妇产科的应用…8
1.1.2 抗肿瘤活性机制…8
1.1.3 抗 HIV 活性机制………..…………8
1.1.4 广谱抗病毒活性机制………………9
1.2 天花粉蛋白基因在植物中的应用研究…9
1.2.1 对植物病毒的抗性研究……………9
1.2.2 对真菌的抗性研究10
1.2.3 对昆虫的抗性研究……..……..……10
1.2.4 对转基因植株中可溶性蛋白的研究..……..…………10
2 天花粉蛋白基因突变体研究进展………………..………………10
3 植物抗病毒基因工程研究进展…………..…13
3.1 植物病毒基因介导的抗性作用机理……14
3.2 烟草抗病毒基因工程研究进展…………15
第二章、材料与方法…..………17
1 材料…..………………..……..17
1.1 植物材料………..…….. 17
1.2 菌种和质粒….….…….. 17
1.3 药品与主要试剂…………….……….….. 17
2 方法………………..………... 17
2.1 农杆菌的活化与菌液的制备………………..... 17
2.1.1农杆菌感受态细胞的制备及其转化………....…….... 17
2.1.2 根癌农杆菌标准生长曲线的绘制………………..……………18
2.1.3农杆菌转化用菌液的制备……….……...……………..18
2.2 烟草的转化及其转化体的再生……………….……………..18
2.2.1烟草叶片愈伤组织的诱导与植株再生……….…………….…………..18
2.2.2试验处理及其统计分析..…………..19
2.3 天花粉蛋白突变基因在烟草中的转化………….…………….………..……..19
2.4 转基因植株的检测……….………………..……….………..20
2.4.1转基因植株总 DNA 的提取………….…………..…..20
2.4.2转基因植株的 PCR 检测…………….…………..…..20
2.5转基因植株的细胞学检测...……….……….21
2.5.1转基因植株及其对照的处理……………..….………..……………..21
2.5.2石蜡切片………………...……………..…………….…..21
2.5.3转基因植株的细胞学鉴定…………….……………..….23
2.6转基因植株的抗病性检测………………..……………….23
2.6.1转基因植株的病毒接种与观测……..…………….…….23
2.6.2TCA-丙酮法提取植物蛋白……..………………..…….23
2.6.3SDS-PAGE 电泳方法..……………….24
第三章、结果与分析……………....…………...25
1 天花粉蛋白突变基因 TCSA-S 在烟草中的转化……………….…………...25
1.1 根癌农杆菌标准生长曲线的绘制………………..……………25
1.2 烟草叶片愈伤组织的诱导与植株再生…..25
1.3 培养条件对烟草转化率的影响……………..………………26
1.4 天花粉蛋白突变基因 TCSA-S 在烟草中的转化………….….27
1.5 转化体的筛选.……….28
2 转基因植株的检测…………….……….……………..………….29
3 转基因植株的细胞学观察……………..……………..………….29
3.1 转基因烟草的 Gus 基因检测………………...………….29
3.2 转基因烟草的细胞学观察.29
3.2.1 叶片组织细胞学观察…….………..….29
3.2.2 茎的组织细胞学观察……….…………29
3.2.3 根的组织细胞学观察.30
3.2.4 石蜡切片细胞学观察与比较…………….….…………...30
4 转基因植株的抗病性检测..………...…………….……………..30
4.1 ToMV 病毒接种烟草转化体的症状及特征…………..…..……………..31
4.2 CMV 病毒接种烟草转化体的症状及特征.………...…………….……………..31
4.3 感病植株中病毒外壳蛋白测定………………..…..…………..31
第四章、讨 论..….….…...………33
1 影响烟草基因转化率的因素…….…………….33
2 基因转化的受体系统……..……………….…………..………….34
3 植物切片效果的影响因素…35
4 TCSA-S基因表达对植株的损伤..………….……………35
5 天花粉蛋白突变基因TCSA- S的效应…..…………………36
第五章、结 论…….…………39
参考文献…………….…………41
附录……………….………47
附图…………...…………..50
致谢……56
攻读硕士学位期间发表的学术论文……………….………………57
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