原核基因表达产物分离方法进展及特点
原核基因表达产物最终为蛋白质，利用基因工程的方法，外源基因在原核细胞如大肠杆菌细胞表达目的蛋白，这些目的蛋白往往积累在原核细胞内，而细胞含有多种不同的蛋白质。因此原核基因表达产物的分离和提纯工作是一项艰巨而繁重的任务，涉及到多种分离纯化的方法和工艺。到目前为止，还没有一个单独的或一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来，但对任何一种蛋白质都有可能选择一套适当的分离提纯程序来获取高纯度的制品。
1、蛋白质在原核细胞中的表达形式及对分离方法的影响
根据使用目的的不同和操作方法的差异，蛋白质在原核细胞中的表达形式可以分为非融合蛋白、融合蛋白、分泌型蛋白等形式。
1.1非融合蛋白
非融合蛋白是指表达蛋白的N端和C端均不带非外源基因表达的氨基酸残基。也就是该蛋白与天然蛋白的一级结构相同。往往是具有生物活性的蛋白质，是一些在体内应用的基因工程产品，特别是一些基因工程药物蛋白质。非融合蛋白在原核细胞内不稳定，易降解，不易分离。因此在分离过程中，要注意保持蛋白的稳定性。
1.2 融合蛋白
融合蛋白是指表达蛋白的N端或C端具有非目的蛋白表达的氨基酸残基。融合蛋白的部分原核多肽往往的可以用作分离、纯化、检测目的蛋白的工具，我们把这样的多肽称为“标签（tag）”。然而融合蛋白并非是真正的天然蛋白，因此一般不能在体内应用，但可用于体外诊断。融合蛋白在原核细胞内比较稳定，不易被降解。这并不意味着，在分离融合蛋白时，可以不注意保持蛋白的稳定性。
1.3分泌型表达蛋白
分泌型表达蛋白是指在细菌胞浆内合成的多肽进入内膜和外膜的周间质，而不是指合成的多肽分泌到细胞外。分泌型表达蛋白的生物活性较好，但是由于分泌型表达蛋白的表达量较低，因此使用较少。
2、原核蛋白的分离
2.1 原核蛋白的稳定性因素
原核蛋白分离的目标是将需要蛋白质从细胞的全部其他成分特别是不想要的杂蛋白中分离出来，同时仍保留有这种多肽的生物学活性和化学完整性。这就要求在分离过程中采取措施保持蛋白的稳定性。因为蛋白在生理条件下比较稳定，但分离过程的条件比生理环境下要剧烈，蛋白容易降解。稳定性的因素如下。
2.1.1温度
温度是影响蛋白质稳定的最重要因素。温度越高，蛋白质越不稳定。对大多数蛋白质在0～4℃之间较稳定[1]。因此蛋白质分离的操作应尽量保持在低温。
2.1.2蛋白酶
蛋白在分离过程中，易被各种蛋白酶降解，因此分离过程要尽量快，保持低温，除此之外，还要加入相应的蛋白酶抑制剂，如常用的PMSF（胰蛋白酶抑制剂）。如果蛋白酶抑制剂还不能抑制酶的活性，那在纯化蛋白之前就得利用其酶的性质选择一个合适的方法与目的蛋白分开，以避免目的蛋白被降解[2] 。
2.1.3缓冲液
缓冲液在原核蛋白的分离过程，起到维持pH值的作用。而且要慎重选择缓冲液。要考虑到缓冲液的离子强度。
2.1.4机械力
机械力主要是指摇动和剪切。蛋白质在摇动和剪切作用下可能变性，摇动产生了疏水气液界面，导致蛋白分子在界面排列去折叠，将大量的疏水残基暴露于空气和并开始聚集。所以在分离蛋白时要避免剧烈搅拌和摇晃。
2.2分离提纯方法
从原核细胞的多种蛋白质中纯化出目的蛋白质的原因，是由于不同的蛋白质在物理、化学、和生物学性质存在着极大差异。这样利用目的蛋白质与其它蛋白质之间在性质的差异，即能设计出一组合理的分级分离步骤。因此可以依据蛋白质不同性质与之相对应的方法分离出目的蛋白。
2.2.1凝胶过滤层析
凝胶过滤层析是根据蛋白质分子大小不同而达到分离效果，故又称为凝胶排阻或分子筛[3]。由于原核表达的目的蛋白往往积累在细胞内。因而分离目的蛋白的第一步是破碎菌体细胞。这样目的蛋白中除了混有杂蛋白外，还含有其他杂质，比如，未破碎的菌体细胞、细胞碎片、其它颗粒杂质（病毒颗粒）。此时，可以通过凝胶过滤层析将大分子的杂质地滤去。当然还可用离心、超滤、微孔滤膜过滤等方法。
但是以上方法较费时，不利于保持目的蛋白的稳定。近年来发展了一种叫做扩张床吸附的技术。利用扩张床吸附技术能有效的解决这个问题，吸附介质颗粒在向上流动的上清的作用下扩张起来，上清中的目的蛋白被吸附于介质上，而细胞和其碎片将通过柱子而流出去，而洗脱目的蛋白时从相反方向将吸附介质压紧，再用洗脱缓冲液将目的蛋白洗下来。扩张床吸附技术可以快速除去杂质。可大大减少上清的处理时间，有利保持目的蛋白的稳定性。而且目的蛋白被吸附在层析介质上，它对蛋白酶就不会很敏感。[4]
2.2.2离子交换层析
离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是以离子交换树脂为固定相，依据流动相中的组分离子（带净电荷的蛋白质分子）与交换树脂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。也就说离子交换层析是利用不同蛋白质表面电荷性质的不同达到分离、纯化蛋白质的目的。离子交换层析大体上可分为两个步骤：交换和洗脱。首先流动相中的带电蛋白质分子被离子交换树脂上的平衡离子置换，固定在树脂上。通过溶液中相反离子浓度或降低蛋白质电荷数等方法将蛋白质从树脂上洗脱下来。蛋白质的等电点是进行离子交换的关键。因为进行离子交换层析的最佳pH值一般与蛋白质的等电点相差一个单位。一般地，等电点处于极端位置（pI﹤5或pI﹥8）的基因工程蛋白质首选离子交换层析，这样很容易除掉大部分的杂蛋白。
2.2.3亲和层析
亲和层析是蛋白质分离纯化的一种重要的方法,它具有很高的选择和分离性能以及较大的载量。只需要一步处理即可使某种待分离的蛋白质从复杂的蛋白质混合物中分离出来,达到千倍以上的纯化,并保持较高的活性。亲和层析技术是一类分离纯化方法的统称。它包括免疫亲和层析、凝集素亲和层析、核酸亲和层析、金属螯合亲和层析以及染料配体亲和层析等。它们的共同特征是均是以蛋白质和结合在介质上的配基间的特异亲和力为基础。
2.2.3.1金属螯合亲和层析
在原核蛋白分离纯化中，经常用到的金属螯合亲和层析。金属螯合亲和层析
是指金属离子Cu2＋、Zn2＋和Ni 2＋等以亚胺络合物的形式键合到固定相上，由于这些金属离子与原核表达蛋白中的色氨酸、组氨酸和半胱氨酸之间形成了配价键，从而形成了亚胺金属—蛋白螯合物，使含有这些氨基酸的蛋白被这种金属螯合亲和色谱的固定相吸附。比如，含组氨酸标签的融合蛋白通过Ni 2＋螯合柱的分离。
2.2.3.2疏水作用层析
疏水作用层析是以介质疏水基团和蛋白质疏水区域间的亲和作用为基础的。多数疏水性的氨基酸残基藏在蛋白质的内部，但也有一些在表面。蛋白质表面的疏水性氨基酸残基的数目和空间分布决定了该蛋白质是否具有与疏水柱填料结合从而利用它来进行分离的能力。
因其廉价和纯化后的蛋白质具有生物活性，是一种通用性的分离和纯化蛋白质的工具。溶液盐浓度增加时，疏水作用变得更强。因此，大多数疏水层析程序都是高盐时上样，降低盐浓度时洗脱。所以在硫酸铵沉淀或离子交换层析后可以方便地直接进行疏水层析。[5]
2.2.3.3壳聚糖衍生物亲和层析
壳聚糖衍生物亲和层析是近年来发展起来的。亲和层析常用的琼脂糖和葡聚糖等填料，多为进口，价格昂贵，且在制备时常使用溴化氰等剧毒试剂，须采取特殊防护措施[6]。而甲壳素或壳聚糖资源丰富，结构及性能与琼脂糖和葡聚糖相似，生物相容性较好，具有良好的吸附性能，可直接或经修饰后作为各种层析和蛋白质分离纯化的载体，制备工艺简单，成本较低。[7]
2.2.4高速逆流色谱技术
高速逆流色谱技术是一种不需要固体支持物作为固定相的液液分配色谱技术。兼具大规模制备和小量分析的功能。产品回收率高，样品不须严格预处理，可一步制备纯品，既可用于分析也可进行规模制备。利用高速逆流色谱技术，采用双水相体系，可以进行对目的蛋白进行分离，具有条件温和产品活性保持良好等优点。另外也可以将逆流色谱和硫酸铵沉淀法结合起来，利用蛋白质沉淀性的差异进行蛋白质混合物的分离，分离过程中沉淀的形成不会造成分离柱的堵塞。这相对于传统液-固色谱来说是一个很大的优势[8]。
2.2.5分离纯化标签的应用
为了便于分离，通过改变编码蛋白的 cDNA，而在被表达的蛋白的C端或N端加入少许几个额外氨基酸。这是由基因工程构建的标签，这个加入的标签可用来作为一个有效的纯化依据。
2.2.5.1组氨酸标签
组氨酸标签是最常用的标签之一，是在蛋白质的N端加上6~10个组氨酸，在一般或变性条件（如8M尿素）下借助它能与Ni2+螯合柱紧紧结合的能力，用咪唑洗脱，或将pH降至5.9使组氨酸充分质子化，不再与结合Ni2+使之得以分离纯化。
2.2.5.2精氨酸标签
精氨酸标签一般是指5或6个的精氨酸短肽。它位于融合蛋白的C端，该融合蛋白通过阳离子交换树脂SP-Sephadex而得到分离。分离出的融合蛋白，通过羧肽酶处理最终得到所需蛋白。
2.2.5.3 GST融合载体
使要表达的蛋白质和谷胱甘肽S转移酶一起表达，然后利用Glutathione Sepharose 4B作亲和纯化，再利用凝血酶或因子Xa切开。
2.2.5.4纤维素结合区域（CBDs）
目前已有超过十三种的带有纤维素结合区域（CBDs）的蛋白质家族被鉴定和分类。蛋白质家族Ⅰ的CBDs是一种用于亲和层析的非常有用的标签。该标签位于融合蛋白的N端或C端。它可以与纤维素通过氢键和范德华力特异性地结合在一起。分离时，通过尿素或胍氢化物将融合蛋白洗脱下来。
蛋白质家族Ⅱ和蛋白质家族Ⅲ的CBDs也可用来做分离纯化标签，表达的融合蛋白通过乙烯基乙二醇高效地洗脱。洗脱后，乙烯基乙二醇可以很方便地通过透析除去。
2.2.5.5麦芽糖结合蛋白（MBP）
麦芽糖结合蛋白（MBP）是由大肠杆菌K12的malE基因编码的，分子量达到40KD。MBP可以融合在原核蛋白的N端或C端。MBP标签通过免疫测定的方法检测出。融合MBP的原核表达蛋白通过一步亲和层析，与相互交联的直链淀粉特异性结合而分离出来。分离出的融合蛋白在生理性缓冲液的条件下，通过10mM的麦芽糖洗脱下来。最后用识别特异位点的蛋白酶将MBP切除掉，从而获得所需的目的蛋白。据报道，MBP可以广泛与其它小的亲和层析标签一起使用。[9]
2.2.5.6 SBP-tag
SBP是一种链霉素结合多肽，由38个氨基酸组成。带有SBP-tag的表达蛋白与固相化的链霉素亲和结合，通过2mM的维生素H洗脱分离出来。洗脱条件非常温和，有利保持蛋白的活性。据报道，C端带有SBP-tag蛋白已在细菌中表达并成功分离出来。[10]
2.2.6分离纯化标签的去除
融合表达在最初的鉴定和分离纯化时有标签会方便很多，但是融合表达的问题是最终如何去掉外源的融合标签，特别是用于医疗用途的蛋白质。因为标签的存在会影响目的蛋白的结构，从而影响蛋白的活性和功能。目前主要有两种途径。
2.2.6.1特异蛋白酶(sites-sepecific protease)
特异蛋白酶识别融合蛋白上的特异位点，从而特异性切除外源性的标签。为了保持蛋白的活性，特异蛋白酶最好在低温下操作。还可以通过基因改造的方法让特异蛋白酶带上标签，这样一步就可以把融合蛋白和蛋白酶上的标签一起切除。目前常用的蛋白酶是：肠激酶，凝血酶，Xa因子等。
2.2.6.2内含肽（intein）
目前不使用蛋白酶，而在目的蛋白中引入内含肽，即可达到切除标签的目的。[11]内含肽（intein）兼有蛋白酶和蛋白连接酶的特性，它在还原条件或者pH或温度条件改变下会发生N端自剪接。将表达的目的蛋白与蛋白自剪接元件intein和标签形成融合蛋白，通过亲和层析分离纯化融合蛋白。在特定条件下，诱导内含肽的肽键裂解活性，这样目的蛋白被释放出来，而内含肽和标签仍结合在亲和柱上。
2.3原核表达的包涵体
在大肠杆菌中表达重组蛋白，经常以包涵体的形式沉积于细胞内。包涵体一般含有50%以上的重组蛋白，具有很高的密度（约1.3mg/ml），无定形，呈非水溶性。包涵体的形成主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。此外由于基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，使表达产物积累起来，形成包涵体。包涵体的处理简要叙述如下：破碎菌体细胞，离心、洗涤获得包涵体，通过强变性剂尿素、盐酸胍溶解，再利用各种分离纯化方法得到目的蛋白，最后通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。
总之，蛋白质的分离纯化无固定的模式，不同的蛋白质有不同的方法。同一种蛋白质也可采取不同的方法。因此在进行原核表达蛋白的分离纯化时，通常需要综合使用多种形式分离纯化的技术。一般来说，在选择分离纯化方法时，应遵循以下原则：1、选择不同分离纯化机理的方法共同使用。2、首先设法除除去含量最多的杂质。3、尽量采用高效的分离方法。4、先选用特异性较低、成本较低的分离方法，把最费时、成本最高的方法安排在最后。
参考文献
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