学海网

硕士论文-早期鸡胚原始生殖细胞的分离与培养，共56页，28835字
摘要
本研究是以罗曼鸡 9～10期胚胎生殖新月区、12～17期胚胎血液为试验材料，分别
制备了生殖新月区的组织切片和胚胎血液涂片，用 PAS染色法鉴别、计数及分析原始生
殖细胞（Primordial germ cells，PGCs）形态结构特征。同时，分别采用 EDTA-胰酶酶解
法和 Ficoll密度梯度离心法分别提取生殖新月区及血液中的 PGCs，并且将分离的 PGCs
在不同条件下分别进行体外培养，以探索有效的 PGCs培养条件，为今后制作生殖腺嵌
合体及转基因禽类的研究奠定基础。试验结果如下：
1. PGCs的形态
生殖新月区的 PGCs呈不规整的圆形或卵圆形，细胞内含有大量的糖原颗粒，细胞
直径为 20±1.8μm，核的大小为 7.9±1.5μm。血液中 PGCs呈规整的圆形，糖原颗粒减少
直径为 17.2±2.1μm，核的大小为 7.0±1.1μm。
2. PGCs的分离及纯化
经分离纯化，在每个生殖新月中平均获得 107.1±8.9个 PGCs。在 12～17期胚胎中，
13和 14期胚胎血液中 PGCs数目最多，分别为 37.8±3.7个/μl和 40.8±4.7个/μl，浓度
分别为 0.01028%和 0.00816%，至 17期大部分 PGCs进入原始生殖嵴，血液中的数量减
为 3.0±1.1个/μl，证明 14期应为采集 PGCs最佳时期。将 13～14期胚胎血液采用 Ficoll
密度梯度离心法进行纯化，分离效果为 94.5±1.2%，纯度为 27.7±1.7%。
3. PGCs体外培养研究
将分离的 13～14期鸡胚血液中 PGCs在不同饲养条件下培养，当在无饲养层的
M199基础培养基中培养，PGCs可存活 2～d天。培养期间细胞生存率直线下降，第 3
天时细胞存活率降至 14.6±6.8%，至第 4d时细胞存活率不足 1%。当 PGCs在鸡成纤维
细胞饲养层上培养并添加有 bFGF时，生存时间延长，第 3d和第 5d存活率分别为
59.9±9.8%、32.3±7.6%，并表现出较弱的增殖能力。
关键词：鸡；原始生殖细胞；分离；培养
目录
摘要………..Ⅰ
英文摘要…………..…….….Ⅱ
中英文对照表……..….……..Ⅲ
文献综述 …………… . …… ..1
1 引言………..1
2 PGCs 的生物学特性……….1
2.1PGCs 的起源……..…………….………….1
2.2 PGCs 的形态…...………..2
3 PGCs 迁移..2
3.1 PGCs 的分离期………...2
3.2 PGCs 的迁移期…………..2
3.3 PGCs 的安置期………….……………....3
4 鸡胚 PGCs 的研究进展…..5
4.1 PGCs 的分离纯化 ……....5
4.2 PGCs 的体外培养……....6
4.3 PGCs 移植及转基因研究……………......7
4.4 嵌合体的鉴定…...…….....8
5 禽类 PGCs 的应用展望………...…………8
5.1 在畜牧业生产中的应用………..…….....8
5.2 在医药领域中的应用8
试验材料与常用方法…………….....10
1 试验材料 ..10
1.1 试验动物………..………10
1.2 主要试剂…………….....10
2 常用的试验方法…………10
2.1 鸡蛋的孵化…………...10
2.2 玻璃针的准备……….....10
2.3 取胚方法…………….....10
2.4 生殖新月的分离与消化…………….....11
2.5 早期胚胎血液中 PGCs 的采集……11
2.6 PAS 特异性染色……11
2.7 石蜡切片苏木精-PAS 染色…………....12
2.8 PGCs 存活率检测……....12
3 统计学分析12
研究内容……13
1 生殖新月和血液 PGCs 分离及纯化……………..13
1.1.1 试验材料……………13
1.1.2 试验方法……………13
1.1.2.1 生殖新月区 PGCs 的分离………13
1.1.2.2 胚胎血液 PGCs 的分离纯化……13
1.2.3 纯化后 PGCs 活力的检测…………13
1.2.4 PGCs 的鉴别……….13
1.3 结果…….14
1.3.1 生殖新月区 PGCs 的分离…………....14
1.3.2 血液中 PGCs 的分离纯化…………...14
1.4 讨论……15
1.5 小结……16
2 生殖新月和血液 PGCs 的形态学研究…………..18
2.1 材料与方法……………18
2.1.1 材料…18
2.1.2 方法…18
2.2 结果……19
2.2.1 生殖新月区的 PGCs 的形态学研究19
2.2.2 生殖新月区 PGCs 的组织化学观察20
2.2.3 血液中 PGCs 的形态观察…………20
2.2.4 血液中 PGCs 核的形态观察…………21
2.3 讨论…… ………… … ……… ……22
2.4 小结…….22
3 血液 PGCs 的培养..24
3.1 材料……24
3.2 方法 …… 24
3.2.1 鸡胚成纤维细胞的分离培养………24
3.2.2 血液 PGCs 的培养…25
3.3 结果……26
3.3.1 成纤维细胞的培养…..26
3.3.2 不同培养条件下 PGCs 的存活情况. 27
3.4 讨论……30
3.5 小结……31
全文结论..32
参考文献……33
附录…………38
致谢…………41