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硕士论文-鸡胚性腺原始生殖细胞分离培养的研究，共61页，33940字
摘 要
本试验以罗曼鸡和寿光黑鸡胚胎性腺为实验材料，分别制作18-28期鸡胚的石蜡组
织切片和18-28期鸡胚性腺细胞涂片，并进行PAS、Hoechst33258染色，观察和比较gPGCs
在正常组织与消化分离后的形态结构特征。同时对18-28期胚胎gPGCs进行消化分离、纯
化及培养。在此基础上，用纯化的gPGCs在不同的培养体系中培养。本研究的目的旨在
明确鸡胚原始生殖细胞（gPGCs）在迁入生殖原基之后的形态学与分布特征，掌握有效
的分离gPGCs的方法，探索gPGCs体外培养的影响因素及有效地培养条件，为发展鸡gPGCs
的体外操作技术奠定基础。试验结果如下：
Ⅰ.PGCs形态学研究
组织切片观察表明， gPGCs呈圆形或卵圆形，有伪足，直径为10μm-15μm，胞核呈
圆形或椭圆形，偏向细胞边缘，大小为5μm-7.5μm。核内缘有少量异染色质，常染色质
均匀分布。细胞悬液涂片观察表明，游离的gPGCs呈圆形或卵圆形，有伪足，周围有明
显的光环；直径为12.5μm-20μm，PAS反应呈阳性。Hoechst33258染色后可见其胞核呈肾
形或椭圆形，偏向细胞的边缘，大小为5μm-7.5μm×12.5μm。核内缘有少量异染色质， 常
染色质均匀分布。另外，可见27期鸡胚性腺中部分PGCs仍处于分裂状态，其胞体为
12.5μm×32.5μm，Hoechst33258染色后，可见核位于中央且均等分布于赤道面两侧，大
小为7.5μm×12.5μm。
Ⅱ.PGCs分布特点
组织切片观察表明，gPGCs刚迁入性腺时，均等分布于两侧。22-23期gPGCs开始由
右侧经背肠系膜向左侧迁移。27期时，靠近左侧性腺的背肠系膜边缘仍有部分PGCs，呈
单个或成群分布。此时，左侧性腺gPGCs数目明显多于右侧。且gPGCs大部分位于性腺的
皮层。说明27期为gPGCs从右侧性腺向左侧迁移的最后时期。
Ⅲ.生殖原基中PGCs增长变化趋势
分离18-28期罗曼鸡和寿光鸡胚胎性腺PGCs，并计数作统计分析。发现：gPGCs在性
腺中主要有两个快速增长期：18-19期和23-27期。28期时，每只罗曼鸡胚胎gPGCs个数
显著高于寿光鸡。这可能是导致罗曼鸡产蛋率高于寿光鸡的原因之一。
Ⅳ.PGCs的分离纯化
28期时，每只罗曼鸡胚胎获得gPGCs为1745.07±306.5，占1.98%。每枚寿光鸡胚胎
可获得gPGCs1401.80±289，占1.61%。将酶解法分离后获得的性腺混合细胞培养24h，
重新悬浮后将部分贴壁的基质细胞除去，每枚罗曼鸡可获PGCs512.5±104.2个，寿光鸡
胚胎个数为：432.5±106.5。Ficoll分离后，每只罗曼鸡和寿光鸡胚分别可获得435.5
±120.5和356.7±103.5个PGCs，分别占2.07%和1.87%。
Ⅴ.PGCs的培养研究
28期胚胎性腺消化分散后，将PGCs分别培养于由添加bFGF和未添加bFGF的基础培养
基和无饲养层和以鸡胚成纤维细胞为饲养层组成的四个培养体系中，结果发现，添加
bFGF，可显著提高gPGCs的存活率，以CEF为饲养层并添加bFGF培养基可显著提高存活率
和促进生长。
关键词：鸡;性腺原始生殖细胞;分离;培养
目 录
摘要……………… ……1
英文摘要………………… …………………3
英文缩略词对照表及注释………………… 5
前言………… …………6
1.禽类胚胎学基础…… 7
1.1 禽类卵子的结构组成…… …………… 7
1.2 禽卵的受精…………… ……………… 7
1.3 禽胚早期发育………… ……………… 7
2.禽类原始生殖细胞研究进展…………… 9
2.1 PGCs 的形态………9
2.2 PGCs 起源及迁移…9
2.3 禽胚 PGCs 的分离与培养…………… 13
2.3.1 禽胚 PGCs 的分离13
2.3.2 禽胚 PGCs 的培养14
2.3.3 影响 PGCs 生长的因素…………… 16
实验内容………………… ………… ……… ……………19
1.鸡胚生殖原基 PGCs 形态学研究……… 19
1.1 材料………………… …………………19
1.2 方法………………… …………………19
1.3 结果………………… …………………21
1.4 讨论………………… …………………22
2.鸡胚性腺原始生殖细胞的分离………… 24
2.1 材料………………… …………………24
2.2 方法… ……………24
2.3 结果… ……………26
2.4 讨论… ……………28
3.鸡胚性腺原始生殖细胞的培养…………30
3.1 材料………………30
3.2 方法………………30
3.3 结果………………32
3.4 讨论 ………………35
结论36
参考文献………………37
附录44
图版说明………………47
致谢51