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免费下载硕士论文-鹅细小病毒非结构蛋白NS1基因的克隆及原核表达

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资料简介
硕士论文-鹅细小病毒非结构蛋白NS1基因的克隆及原核表达,共60页,23450字
摘要
鹅细小病毒(Goose Parvovirus,GPV)是小鹅瘟的直接病原。临床病理变化以消化道,尤
其是小肠部位典型纤维性栓塞为特征。我国学者方定一于 1961 年首次分离到 GPV 的病原体。
GPV 是细小病毒科、细小病毒属成员,属自主复制型细小病毒。病毒基因组为单股、线性 DNA,
核苷酸序列长约 5.1kb,含有两个开放阅读框架(ORF),右侧 ORF(RORF)编码 3 种结构蛋白(VP),
即 VP1、VP2、VP3;左侧 ORF(LORF)编码非结构蛋白 NS1 和 NS2,参与调节病毒生命周期的各个
环节。
检索 GenBank 所发表的 GPV B 株全基因序列,借助 Primer Premier 5.0 和 Oligo 6.44 软件
设计一对引物,采用 PCR 技术扩增 GPV YZ 株非结构蛋白 NS1 基因,并与 PMD18-T 载体连接后测
序。利用软件 dnassist 2.2 对测序结果进行分析,结果表明:GPV YZ 株非结构蛋白 NS1 基因核
苷酸全长 1881bp,编码 627 个氨基酸残基。与 GPV B 株的 NS1 基因相比,核苷酸数目相同,有
36 个碱基、13 个氨基酸的差异。二者核苷酸序列同源性为 98.09%,推导氨基酸序列同源性为
97.93%。
将 NS1 基因插入到原核表达质粒 PQE-30Xa 的 BamH I、Sal I 多克隆位点之间,将重组原核
表达质粒 PQE-30Xa-NS1 转化到大肠杆菌 M15 感受态细胞中,获得表达 NS1 基因的阳性重组子,
在含 Amp 的 LB 液体培养基中培养,经 IPTG 诱导表达,用 SDS-PAGE 分析表达产物。结果表明:
NS1 基因在原核表达细菌大肠杆菌 M15 中获得了高效表达,表达产物为约 73ku 的融合蛋白,表达
量达菌体总蛋白的 26.5%。
应用蛋白质分析软件 ANTHEPROT 5.0 对得到的 GPV YZ 株的 NS1 蛋白进行蛋白序列的理化特
性、蛋白质的二级结构、蛋白滴定曲线与等电点、蛋白序列分子量、比重与各蛋白残基百分组成、
蛋白质信号肽潜在的断裂位点等进行分析,得出了相应的特征曲线和分析结果,为进一步研究其
生物和免疫学性质奠定了基础。
关键词:鹅细小病毒、NS1 基因、克隆、序列分析、原核表达
目录
摘要
Abstract
第一部分 文献综述
1 小鹅瘟的研究简史
2 小鹅瘟的病症学概况
3 鹅细小病毒的类型
4 鹅细小病毒的生物学特性
4.1 GPV 的分类及形态学特征
4.2 GPV 的理化特征
4.3 GPV 的培养特性
5 鹅细小病毒的基因组结构特点
6 鹅细小病毒的结构蛋白与非结构蛋白
6.1 结构蛋白
6.2 非结构蛋白
7 鹅细小病毒与其它细小病毒的关系
7.1 鹅细小病毒与番鸭细小病毒的关系
7.2 鹅细小病毒与依赖病毒属成员的关系
7.3 鹅细小病毒与红病毒属成员的关系
8 本试验的目的和意义
第二部分 材料与方法
1 材料与仪器
种毒
质粒与菌种
引物
主要试剂
主要仪器设备
2 实验方法
2.1 GPV病毒的增殖及鉴定
2.2 GPV病毒核酸的提取(蛋白酶K、SDS 法)
2.3 GPV的NS1基因的PCR扩增
2.4 GPV的NS1基因扩增产物的纯化
2.5 目的 DNA 片段克隆至 PMD18-T 载体并测序
2.5.1 制备 JM109 感受态细胞
2.5.2 NS1 基因与 PMD18-T 载体连接和转化
2.5.3 碱裂解法小剂量制备质粒
2.5.4 阳性重组质粒 PMD18-T-NS1 的鉴定
2.5.4.1 阳性重组质粒 PMD18-T-NS1 的酶切鉴定
2.5.4.2 阳性重组质粒 PMD18-T-NS1 的 PCR 鉴定
GPV 株 NS1 基因的序列鉴定
GPV 株 NS1 基因的序列分析
目的 DNA 片段克隆至 PQE-30Xa 载体并在大肠杆菌 M15 中表达
阳性重组质粒 PMD18-T-NS1 的双酶切
带粘性末端的 NS1 基因片段的纯化
PQE-30Xa 的双酶切
PQE-30Xa 的双酶切产物的纯化
NS1 基因与 PQE-30Xa 的连接和转化
阳性重组质粒 PQE-30Xa-NS1 的鉴定
阳性重组质粒 PQE-30Xa-NS1 的酶切鉴定
阳性重组质粒 PQE-30Xa-NS1 的 PCR 鉴定
阳性重组质粒 PQE-30Xa-NS1 转化入大肠杆菌 M15
阳性菌株的酶切鉴定
阳性重组子的诱导表达
表达产物的 SDS-PAGE 电泳和薄层扫描分析
SDS 聚丙烯酰胺凝胶的配制
SDS 聚丙烯酰胺凝胶的灌制
SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶的染色、脱色和干燥
第三部分 结果与讨论
1 结果
病毒的增殖和鉴定
GPV YZ 株 NS1 基因的克隆及序列分析
GPV YZ 株 NS1 基因的扩增
重组质粒 PMD18-T-NS1 的酶切鉴定
NS1 基因的测序结果及序列分析
GPV YZ 株 NS1 基因原核表达载体的构建
重组质粒 PQE-30Xa-NS1 的酶切鉴定
大肠杆菌 M15 阳性菌株的筛选与酶切鉴定
NS1 基因的表达及 SDS-PAGE 分析
表达产物的 SDS-PAGE 分析
表达产物的薄层扫描定量分析
NS1 基因表达蛋白的软件分析
蛋白序列的理化特性曲线
1.5.2 蛋白质的二级结构预测
Gibrat 方法
Levin 方法
Garnier 方法
DPM 方法
1.5.2.5 几种方法综合使用
2 讨论
蛋白序列滴定曲线与等电点
蛋白序列分子量,比重与各蛋白残基百分组成
蛋白质信号肽潜在的断裂位点预测
GPV YZ 株非结构蛋白 NS1 基因的克隆及序列分析
重组原核表达载体的构建
NS1 基因的原核表达及 SDS-PAGE 分析
PQE-30Xa 表达系统
蛋白质分析软件 ANTHEPROT 5.0 的使用
3.结论
参考文献
附录
1 pQE-30 Xa 载体模式图
2 英文缩写词表
致谢
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