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硕士论文-小鼠胚胎干细胞分离培养的研究，共61页，28979字
摘要
目的：
筛选一种简单有效的小鼠 ES 细胞培养方法；获得一定代次的小鼠 ES 细胞；通
过培养新生鼠脑神经细胞，探讨适合神经细胞生长的培养条件，为小鼠 ES 细胞神经
向定向诱导分化及其在脑病模型上的应用奠定基础。
方法：
本试验为 2 个部分：两种基础培养体系的建立和小鼠 ES 细胞的分离培养。其中
基础培养体系分为：小鼠胎儿成纤维细胞的培养、冷冻与饲养层的制备；新生鼠脑神
经细胞的分离培养。
1.分别选择妊娠 12.5、14.5、16.5d 的雌性小鼠采集胎儿做成纤维细胞培养，消化
培养时采用 3 种方法：组织块培养、单细胞培养和组织块单细胞混合培养，比
较培养结果。
2.比较两种饲养层处理方法：先用终止细胞分裂后传代法和先传代后终止细胞分
裂法，比较两种方法制备饲养层的效果。
3.新生鼠脑组织剪碎、简单消化后作组织块单细胞混合培养，观察培养结果。
4.分别于第 3.5 和 4d（检出阴道栓记为 0.5d）采集胚胎，比较囊胚率及其对 ES
细胞分离培养的影响。
5.分别采用 4 种培养方式：饲养层＋不含 LIF 的培养液、饲养层＋含 LIF 的培养
液、LIF 辅助培养液、1/2LIF 辅助培养液＋1/2 条件培养液，比较小鼠 ES 细胞
分离培养效果。
6.分别于胚胎培养 2～3d、5～6d、8～10d 传代类 ES 集落；消化采用两种方式：
单集落消化和多集落一起消化，比较效果。
7.选择最好的方法做小鼠 ES 细胞分离培养。
结果：
1. 采用 14.5d 的小鼠胎儿做成纤维细胞培养效果最好；组织块培养法获得的细胞
纯度高，单细胞培养法获得的细胞纯度低，混合培养法界于两者之间，但是
操作简单。
2.先终止细胞分裂后传代法传代后死亡细胞数多，通常要补加一次，操作繁琐；
先传代后终止细胞分裂法效果优于前者。
3.神经细胞生长良好，呈典型神经细胞形态。
4.第 4d 采集的胚胎囊胚率高，作 ES 细胞培养效果好。
5.饲养层＋含 LIF 的培养液效果最好；LIF 辅助培养液和 1/2LIF 辅助培养液＋1/2
条件培养液次之，但两组间无显著差异；饲养层＋不含 LIF 的培养液效果最差。
6.胚胎培养 5~6d 传代效果优于 2~3d 和 8~10d；采用多集落混合培养操作更简单，
效果较单集落消化法好。
7.采用饲养层＋含 LIF 培养液和 LIF 辅助培养液培养小鼠类 ES 细胞至第四代，
细胞生长呈典型的 ES 细胞集落。
结论：
取 14.5d 的小鼠胎儿采用组织块培养法或混合培养法做成纤维细胞培养，5 代前
接种到四孔皿中，长满后用丝裂霉素 C 终止细胞分裂，不传代，洗涤处理后加入含
LIF 的培养液用作小鼠 ES 细胞分离培养体系，效果较好。
于第 4d 采集小鼠囊胚或扩张囊胚，LIF 辅助培养液中培养 5～6d 挑选类 ES 细胞
集落消化传代，接种于饲养层细胞＋含 LIF 培养液的培养体系或无饲养层培养体系中
培养，每 1～2d 半量换液，6～8d 传代一次，目前能稳定传至第四代。本方法简单可
行，可用于小鼠 ES 细胞的分离培养。
新生鼠脑组织剪碎消化后用 DMEM+10%FBS+ITS 培养，于 37℃、5%CO2、饱
和湿度，可获得生长良好的神经细胞。该培养条件适合神经细胞生长，可以用于小鼠
ES 细胞神经向诱导分化后的培养。
关键词
KM 小鼠
胚胎干细胞
胎儿成纤维细胞
神经细胞
饲养层
条件培养液
培养
目录
英文缩写注释 …………….Ⅹ
第一章 综述与前言 ………1
综述 …..1
前言 …..11
第二章 基础培养体系的建立 ……………13
试验一、小鼠胎儿成纤维细胞的培养、冻存与饲养层的制备
…………13
前言13
材料与方法………13
试验结果…………17
讨论19
结论.20
试验二、新生鼠脑神经细胞的分离培养…………….21.
前言.21
材料与方法……….21
试验结果………….23
讨论.25
结论.25
第三章 小鼠胚胎干细胞的分离培养………26
硕士研究生论文
前言….…26
材料与方法…………….27
试验结果.29
讨论…….34
结论……..36
附录…………..37
附录 A……37
附录 B……38
附录 C……41
致谢……………43
参考文献………44
发表论文、从事科研项目以及获奖情况……49