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硕士论文-乌骨鸡黑色素皮质激素受体-1基因(MC1R)的克隆表达，共63页，29374字
摘 要
乌骨鸡是中国特有的品种，主要特点为乌骨、乌皮、乌肉，具有极高的营养价值。
研究表明，乌骨鸡的营养价值主要体现在其体内的黑色素。因此，本研究旨在克隆乌骨
鸡黑色素主效基因:黑色素皮质激素受体-1(melanocortin1-receptor,MC1R)，并转染哺乳动
物成纤维细胞，以期获得稳定表达的细胞系，为转基因动物的制备打下基础。
本试验提取乌骨鸡肌肉 RNA，并反转录成 cDNA，根据 GeneBank 发表的原鸡 MC1R
序列设计引物，使用 PCR 方法扩增乌骨鸡 MC1R 基因序列，并连接至 pMD-18T 载体上，
测序后，经限制性内切酶 EcoRⅠ和 SalⅠ双酶切回收，并与同样经 EcoRⅠ和 SalⅠ双酶
切的 pET-32a 相连，转化至 E.coli DH5α 中。待酶切鉴定与测序正确后，转化至 E.coli
BL21(DE3)中，经氨苄青霉素筛选，IPTG 诱导表达。经 SDS-PAGE 检测，表达产物相
对分子量约 57KD。利用 Ni2+能与融合蛋白上的多聚组氨酸结合的特点，进行 Ni2+亲和
层析纯化，纯化得到的蛋白使用 SDS-PAGE 检测纯化效果。纯化得到的蛋白与弗氏佐剂
乳化后，皮下注射免疫家兔，经四次免疫后，收集其抗血清，制备兔抗鸡 MC1R 多克隆
抗体，经琼脂糖扩散实验检测证明，抗血清效价较高，可做 western blot 检测用。
同时，本试验还将含有 EcoRⅠ和 SalⅠ双酶切位点的 MC1R 序列片段与同样经
EcoRⅠ 和 SalⅠ 双 酶 切 的 真 核 表 达 载 体 pEGFP-N1 相 连 ， 构 建 真 核 表 达 载 体
pEGFP-N1-MC1R。经酶切鉴定与测序正确后，通过电穿孔的方法转染至山羊成纤维细
胞 中 。 经 20μg/ml G418 筛 选 出 阳 性 克 隆 。 然 后 通 过 RT-PCR 鉴 定 重 组 质 粒
pEGFP-N1-MC1R 已经整合至山羊成纤维细胞基因组中并已开始表达。最后利用实验一
制备的兔抗鸡 MC1R 抗血清进行 western blot 检测，结果显示：乌骨鸡 MC1R 基因在山
羊成纤维细胞中稳定表达，获得了稳定表达乌骨鸡 MC1R 基因的稳定表达的细胞系。
关键词：乌骨鸡；MC1R；山羊成纤维细胞；电转染； 真核表达
目 录
摘 要............. 1
ABSTRACT......... 2
英文缩写词表....... 1
前言........... 1
文献综述........... 1
乌骨鸡黑色素研究进展....... 1
1、禽类黑色素的分类、形成、结构............ 1
2、乌骨鸡黑色素的功能..... 2
3、乌骨鸡黑色素在体内的沉积顺序............ 2
4、乌骨鸡黑色素相关基因..... 3
4.1 黑色素皮质激素受体基因（MC1R） ........... 3
4.2 酪氨酸相关蛋白基因（TYRP）............ 3
4.3 皮肤黑色素抑制基因（ID） ... 4
4.4 黑色素相关的其它基因.... 4
转基因动物研究进展....... 4
1、转基因动物的制备方法..... 5
1.1 显微注射法......... 5
1.2 精子介导法......... 6
1.3 胚胎干细胞法（embryonic stem cell,Es cell） ...... 7
1.4 病毒载体法......... 8
2、转基因动物的应用..... 8
2.1 用于人类疾病动物模型的建立........... 8
2.2 用于转基因育种........ 8
2.3 用于转基因产品的制备.... 9
试验一 乌骨鸡黑色素基因 MC1R 的原核表达及多克隆抗体的制备 ........... 10
1、试验材料....... 10
1.1 菌株及载体...... 10
1.2 材料与试剂...... 10
1.3 主要仪器设备...... 10
2、试验方法....... 11
2.1 乌骨鸡 mRNA 的提取.... 11
2.2 反转录 cDNA 的合成 ..... 11
2.3 目的基因的合成...... 11
2.4 重组表达载体 pET-32a-MC1R 的构建 ........... 14
2.5 重组表达载体 pET-32a-MC1R 的诱导表达 ....... 16
2.6 重组蛋白的纯化回收...... 17
2.7 抗乌骨鸡 MC1R 多克隆抗体的制备 ............ 18
3、结果与分析....... 19
3.1 乌骨鸡 MC1R 基因的 PCR 扩增 .......... 19
3.2 目的片段的克隆及鉴定... 19
3.3 重组质粒 pET32a- MC1R 的酶切鉴定 ........ 19
3.4 乌骨鸡 MC1R 核苷酸序列及氨基酸序列分析 ........ 20
3.5 重组菌体的诱导表达和 SDS-PAGE 分析 ....... 21
3.6 抗血清效价的测定....... 22
4、讨论........... 22
4.1 乌骨鸡 MC1R 基因序列分析 ............ 23
4.2 酶切位点的选择....... 23
4.3 表达系统的选择....... 24
4.4 多克隆抗体的制备....... 24
试验二 乌骨鸡黑色素基因 MC1R 的真核表达 ........ 25
1、材料........... 25
1.1 菌株与细胞....... 25
1.2 载体........... 25
1.3 主要试剂....... 25
1.4 主要仪器设备....... 25
2、方法........... 26
2.1 山羊成纤维细胞的培养... 26
2.2 pEGFP-N1-MC1R 真核表达载体的构建......... 26
2.3 以电穿孔法将重组载体 pEGFP-N1-MC1R 转染山羊成纤维细胞 ....... 29
2.4 转染细胞阳性克隆的 RT-PCR 鉴定......... 29
2.5 乌骨鸡 MC1R 蛋白表达的免疫印迹检测 ........ 30
3、结果........... 31
3.1 pEGFP-N1-MC1R 真核表达载体的 PCR 及酶切鉴定... 31
3.2 转染后山羊成纤维细胞的培养... 32
3.3 转染细胞阳性克隆的 RT-PCR 鉴定......... 33
3.4 蛋白表达产物的 Western blot 鉴定......... 34
4、讨论........... 34
4.1 关于外源 G 蛋白偶联受体的表达问题........ 34
4.2 关于真核表达载体系统的选择... 35
4.3 细胞克隆的 RT-PCR 鉴定.. 35
全文总结......... 36
参考文献......... 37
致 谢........... 42
附 录........... 43