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硕士论文-小鼠Hsp70基因序列分析及其在囊胚内表达的研究，共68页，29251字
摘 要
TRIzol 法提取 40℃热应激 1h 小鼠肝脏总 RNA，根据 Genbank 中小鼠 Hsp70
cDNA 序列设计引物，用 RT-PCR 方法克隆了昆明小鼠 Hsp70 cDNA 全长序列
并对其进行序列和分子进化分析。同时将体外培养至囊胚的小鼠胚胎分为 7 组，
每组 50 枚。其中，40℃热应激 3 组，38℃热应激 3 组，分别应激 1h，2h，3h，
然后在 37℃条件下分别恢复 3h，2h，1h；对照 1 组，37℃培养 4h，每组进行
三个重复，然后提取胚胎细胞内总 RNA，根据所测序列和 Genbank 发表序列设
计引物，18S rRNA 引物作为内参，用半定量 RT-PCR 和实时荧光定量 RT-PCR
方法检测热应激小鼠囊胚内 Hsp70 mRNA 的表达水平。试验结果如下：
1. 用 RT-PCR 方法成功克隆了 1926bp 的 Hsp70 cDNA 全长序列，与 Genbank
已发表序列经 BLAST 分析同源性为 99.3%，共有 13 个位点发生突变，导致氨
基酸残基 7 处发生替换，氨基酸列同源性为 98.8%，但是蛋白质等电点无变化，
为 5.516。蛋白二级结构分析显示，α-螺旋占 39％，β-折叠占 10％，Turn（转
角）占 6％，Coil（无规则卷曲）占 45％。
2. 用 DNAStar protean 软件对小鼠 Hsp70 与其他各动物物种 Hsp70 进行分
子进化分析显示，小鼠 Hsp70 与大鼠 Hsp70-1A，Hsp70-1B，Hsp70，牛 Hsp70-1A，
Hsp70-1B，人 Hsp70-1A，Hsp70-1B，狗 Hsp70 同源性较高，与其他物种同源
性相对较低，与山羊 Hsp70 同源性仅为 81.1%。
3. 用 18S rRNA 做内参对小鼠热应激囊胚内 Hsp70 mRNA 的表达进行半定
量分析显示，各试验组，包括对照组都有 Hsp70 基因的表达，其中，38℃热应
激组的小鼠囊胚在热应激开始 1h 后，细胞内 Hsp70 mRNA 水平无明显变化，
热应激 2h 后 Hsp70 mRNA 达到较高水平，之后下降；40℃热应激组在热应激
开始 1h 后小鼠囊胚细胞内 Hsp70 mRNA 就达到较高水平，为对照组的 5.893 倍，
之后随热应激时间延长而下降。
4. 以 18S rRNA 做外标，用实时荧光定量 RT-PCR 定量分析了小鼠囊胚细
胞内 Hsp70 mRNA 的变化水平，结果显示，38℃ 1 h 热应激组的 Hsp70 mRNA
较对照组略有增加，仅增加 4.59 倍，热应激 2 h 后达到较高水平，是对照组的
137.19 倍，然后开始迅速下降，热应激 3h 后，下降到对照组的 29.86 倍。40℃
热应激 1 h 后，胚胎细胞内 Hsp70 mRNA 是对照组的 103.97 倍，然后随应激时
间的延长开始下降，到热应激 2 h 和 3 h 后分别下降至对照组的 51.98 倍和 27.86
倍。
上述结果说明，小鼠囊胚对热应激敏感，轻度、短时间微热应激即可启动
小鼠囊胚诱导型 Hsp70 基因高水平表达。在 38℃和 40℃热应激条件下，胚胎
细胞内 Hsp70 mRNA 分别在热应激开始后 2 h 和 1 h 达到较高水平。
关键词：小鼠；囊胚；热应激；Hsp70 基因；RT-PCR；荧光定量 RT-PCR
目录
中文摘要 .............1
英文摘要 .............3
缩略符号 ...........Ⅰ
文献综述 ............. 1
1 前言 ... 1
2 早期胚胎发育与胚胎基因组的表达........ 1
2.1 早期胚胎发育 ............ 1
2.2 胚胎基因组的表达 .... 2
3 热应激与热休克蛋白 70 ............ 3
3.1 热应激与热休克反应 3
3.2 热休克蛋白概述 ........ 4
3.3 热休克蛋白 70 的分类 ............ 4
3.4 热休克蛋白 70 的生物学特性. 5
3.5 热休克蛋白 70 表达的基因调控........... 5
3.6 热休克蛋白 70 的生物学功能. 6
4 热休克蛋白 70 与早期胚胎发育 7
4.1 体内发育胚胎中热休克蛋白 70 的表达............. 8
4.2 体外培养胚胎中热休克蛋白 70 的表达............. 8
研究内容
试验一 小鼠 Hsp70 cDNA 的克隆与序列分析 ..... 10
1 试验材料 ....... 10
1.1 试验动物 .... 10
1.2 试剂 ............ 10
1.3 仪器设备 .... 11
2 试验方法 ....... 11
2.1 引物的设计与合成 .. 11
2.2 TRIzol 法提取肝脏细胞总 RNA.......... 11
2.3 RT-PCR 反应 ............. 12
2.4 Hsp70 基因的克隆与序列分析 ............ 13
3 结果 . 15
3.1 PCR 扩增结果 ........... 16
3.2 单菌落 PCR 结果 ..... 16
3.3 质粒双酶切鉴定 ...... 16
3.4 测序结果与同源性分析 ........ 17
3.5 小鼠 Hsp70 的氨基酸序列与分子进化分析 .... 20
3.6 Hsp70 基因的二级结构分析 .. 23
4 讨论 . 24
试验二 热应激处理小鼠囊胚 Hsp70 mRNA 的表达.......... 26
1 试验材料 ....... 26
1.1 试验动物 .... 26
1.2 试剂与仪器 27
2 试验方法 ....... 27
2.1 胚胎体外培养 .......... 27
2.2 胚胎分组与体外热应激 ........ 27
2.3 RT-PCR 检测 ............. 27
2.4 Hsp70 基因片段的克隆与序列分析 .... 29
2.5 灰度扫描与数据分析 ............ 30
3 结果 . 30
3.1 PCR 扩增产物的电泳结果 ..... 30
3.2 Hsp70 基因克隆的鉴定结果 .. 31
3.3 测序结果 .... 31
3.4 Hsp70 mRNA 表达的半定量分析........ 32
4 讨论 . 32
试验三 荧光定量 RT-PCR 检测热应激小鼠囊胚 Hsp70 mRNA 的表达 ..... 34
1 试验材料 ....... 34
1.1 材料 ............ 34
1.2 试剂与仪器 34
2 试验方法 ....... 34
2.1 胚胎体外培养与热应激 ........ 34
2.2 引物的设计与合成 .. 35
2.3 胚胎细胞总 RNA 的提取与反转录 .... 35
2.4 实时荧光定量 PCR.. 35
3 结果 . 35
3.1 实时荧光定量 RT-PCR 荧光曲线与熔解曲线 . 35
3.2 Hsp70 基因表达水平的变化 .. 37
4 讨论 . 38
结论 ........... 40
参考文献 ........... 41
致谢 ..... 46
附录 ............. 47
攻读硕士学位期间发表的学术论文 ......... 52