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硕士论文-表达狂犬病病毒糖蛋白的犬2型腺病毒活载体重组疫苗安全评价及免疫效力研究，共71页，40655字
摘要
本研究评价了本实验室已构建的狂犬病病毒糖蛋白-犬 2 型腺病毒重组疫苗（以
下简称 CAV2-E3Δ-CGS）在环境释放阶段的生物安全性，进行了生产性试验阶段 3000
条犬的免疫效力研究。
实验一
狂犬病病毒糖蛋白-犬 2 型腺病毒重组疫苗环境释放阶段安全性评价：
根据《农业转基因生物安全管理条例》规定，经国家农业部批准，在吉林省长春
市绿园区城西乡红民村和 吉林省 松源市宁江区良种场 农大 分场两地开展 了
CAV2-E3Δ-CGS 环境释放阶段的生物安全评价。500 条受试犬，分口服和注射 2 组免
疫；免疫时每条犬注射重组疫苗病毒 1ml（ 107.75 TCID50/ml）或口服 3ml（107.75
TCID50/ml），免疫一次，免疫前及免疫后每周或每隔周采血，分别测定如下指标：①
重组疫苗在细胞中和犬体内的遗传稳定性，及其在犬体内其它寄生菌中的转移情况；
②重组病毒在体内的分布、存留时间和免疫犬后的排泄规律；③高倍剂量接种重组疫
苗后对受试犬的影响；④重组疫苗生产人员和试验人员体内犬腺病毒特异性抗体检
测；⑤试验区周围动物体内犬腺病毒特异性抗体检测⑥试验期间和试验结束后 6 个月
内，监测试验所在环境中(粪、尿、土、水等)外源基因的存留情况；⑦疫苗在靶动物
体内诱导产生的抗体水平及消长规律。
结果显示，CAV2-E3Δ-CGS 的基本生物学特性与受体微生物（CAV-2 YCA-18 株）
一致。遗传稳定性检测表明，本疫苗在体外传代 79 次和体内传代 11 次后，重组病毒
的核酸序列和生物特性未发现改变。PCR 方法检测从受试犬口腔、鼻腔、肺部和肠
道中分离到的寄生菌，未发现重组病毒特异性基因组序列。经组织切片观察和免疫组
化检测免疫犬的组织，未发现异常病理学变化，也未检测到重组腺病毒或目的抗原在
犬体内的分布，但病毒分离和 PCR 检测结果显示，重组病毒在受试犬大肠和小肠中
短暂 存留 ，在犬 粪 便 中 短 期内 也能 检测 到 重组病毒的 存 在。 高倍剂量 的
CAV2-E3Δ-CGS 对受试犬无急性、亚急性和慢性毒性作用，无致畸作用，子代犬发育
正常。重组疫苗生产人员和试验人员体内未检测出犬腺病毒特异性抗体。试验区周围
绝大多数动物体内未检测到犬腺病毒特异性抗体，个别犬由于自然感染犬腺病毒野毒
株而带有低水平的犬腺病毒抗体（但无狂犬病抗体）。免疫犬后每周采集试验区域内
有代表性地点的非受试动物粪便、水样及土壤样品，以 PCR 法检测重组腺病毒载体
及外源基因的特异性核酸序列，对其中阳性样品进行病毒的分离鉴定。所有采集样品
均未扩增获得重组腺病毒载体及外源基因的特异性核酸序列。CAV2-E3Δ-CGS 诱导的
抗体平均水平在国际最低保护水平（0.5IU/ml）以上，抗体持续时间至少为 54 周。
实验二
狂犬病病毒糖蛋白-犬 2 型腺病毒重组疫苗生产性实验阶段免疫效力研究：
根据《农业转基因生物安全管理条例》有关规定，我们又在吉林省长春市绿园区
城西乡红民村和吉林省松源市宁江区良种场农大分场两地开展了 CAV2-E3Δ-CGS 的
免疫效果研究。试验中共免疫犬 3000 条，分 2 组即口服组和肌肉注射组；免疫时每
条犬肌肉注射 1ml（107.75 TCID50/ml）或口服 3ml（107.75 TCID50/ml），免疫一次，免
疫前及免疫后每周或每隔周对 2～5％的免疫犬进行了采血抽检。进行了如下试验：
荧光抗体病毒中和试验测定抗体中和效价；HI 检测腺病毒抗体血凝抑制效价；淋巴
细胞增殖试验检测细胞免疫水平；Western-blot 分析抗体组成。
结果显示，CAV2-E3Δ-CGS 在犬体内诱导产生了较高的针对狂犬病病毒和腺病毒
的两种特异性抗体，并能诱导机体产生细胞免疫反应。CAV2-E3Δ-CGS 两种免疫途径
的血凝效价消长规律基本一致，但诱导产生免疫反应的时间有所差别，口服免疫产生
的抗体时间稍晚于注射免疫。犬一次免疫后产生的抗狂犬病病毒中和抗体效价为
4.5±1.1IU，抗体阳转率为 87.1%，中和抗体保护时间至少可持续 54 周。
上述安全性评价及免疫试验结果表明，CAV2-E3Δ-CGS 以口服和注射两种途径免
疫，均具有较高的安全性和较好的免疫效果。
关键词：狂犬病；重组疫苗；环境释放；安全性评价；免疫研究
目录
中文摘要 ..ⅰ
英文摘要 ..ⅲ
缩略符号 ..ⅴ
文献综述 .... 1
1 综述前言 ................ 1
2. 新型狂犬病疫苗的研究概况 ... 2
3 动物腺病毒疫苗载体的研究概况............... 9
研究内容
实验一 CAV2-E3Δ-CG 的环境释放阶段安全评价 ... 18
1. 试验材料与方法 ... 18
1.1 试验材料 ............. 18
1.1.1 细胞和毒株 ....... 18
1.1.2 主要试剂 ........... 18
1.1.3 主要仪器 ........... 18
1. 2 试验方法 ............ 18
1.2.1 病毒的培养和疫苗的制备 18
1.2.2 试验动物及其分组和免疫 19
1.2.3 CAV2-E3Δ-CGS 的遗传稳定性检测 ... 19
1.2.4 CAV2-E3Δ-CGS 在试验犬体内的分布、存留时间及其在犬排泄物中是否存在及存留时间.. 22
1.2.5 高倍剂量接种重组疫苗后对受试犬的影响.......... 24
1.2.6 重组疫苗生产人员和试验人员体内犬腺病毒特异性抗体检测.............. 24
1.2.7 试验区周围动物体内犬腺病毒特异性抗体检测. 24
1.2.8 试验期间和试验结束后 6 个月内，监测试验所在环境中外源基因的存留情况 ... 24
1.2.9 CAV2-E3Δ-CGS 在靶动物体内诱导产生的抗体水平及消长规律.......... 24
2. 结果 ..... 25
3. 讨论 ..... 37
实验二 狂犬病病毒糖蛋白-犬 2 型腺病毒重组疫苗的生产性试验免疫研究 ............... 39
1. 材料与方法 ........... 39
1.1 材料 ... 39
1.1.1 疫苗、细胞和毒株 ............ 39
1.1.2 主要试剂 .......... 39
1.1.3 主要仪器 .......... 39
1.2 方法 ... 40
1.2.1 实验动物及其分组、免疫与采血....... 40
1.2.2 狂犬病毒 CVS-11 株的培养................ 40
1.2.3 CAV2-E3Δ-CGS 的制备..... 40
1.2.4 血清抗体 Western-blot 检测 ................ 41
1.2.5 采用 HI 试验测定犬腺病毒的血凝抑制效价 ...... 41
1.2.6 FAVN 方法测定血清中和抗体的效价. 42
1.2.7 CAV2-E3Δ-CGS 在靶动物体内诱导细胞免疫的水平情况 ... 42
2. 结果 ..... 43
3. 讨论 ..... 46
结论 .. 47
参考文献 .. 49
致谢 .......... 58