学海网

硕士论文-山东省兽医微生物菌毒种平台的初步建立，共94页，36083字
摘要
本研究根据 2006~2007 年山东省畜禽疾病爆发报道和山东省畜禽养殖分布，在山
东省范围内进行大肠杆菌、猪链球菌、金黄色葡萄球菌、鸡伤寒沙门氏菌和新城疫病
毒的病料采集，采集地点分布在济南、潍坊、烟台、临沂、青岛等 9 个地区 17 个规
模牧场及兽医院。
研究对细菌库采用“病料收集—分离培养—生物学特性试验—细菌纯化真空冻
干”的技术路线，分别以动物临床症状、镜检观察、分离培养特性、细菌生化鉴定来
判定和描述细菌特性；对病毒库采用“病料收集—病毒分离培养—生物学特性试验—
—分子生物学鉴定—病毒纯化真空冻干”的技术路线，分别以 HA-HI 试验、动物临
床症状、MDT 和 ICPI 测定初步判定和描述 NDV 的特性，以 RT-PCR 分子生物学试
验进行最终鉴定，来获得菌种资源信息。
本研究共分离鉴定了大肠杆菌 80 株，平台资源号为 1511C0006SL000061～140；
金黄色葡萄球菌 30 株，平台资源号为 1511C0006SL000141～170；猪链球菌 50 株，
平台资源号为 1511C0006SL000171～190 和 1511C0006SL000271～300；鸡伤寒沙门
氏菌 103 株，平台资源号为 1511C0006SL000318～420；特殊菌株 17 株，平台资源号
为 1511C0006SL000301～317。对分离到细菌资源进行生化试验，均符合各自的生化
特性。
本研究共分离到 60 株 NDV，6.6%的新城疫分离株为新城疫弱毒型，35%为中等
毒力型，58.3%为强毒型，都可以特异性扩增出 F 基因片段。山东省 NDV 病毒库的
强毒株与国内外 NDV 序列的 HN 基因同源性在 80%~97%之间，中毒株的同源性在
82%~98%之间，弱毒株的同源性在 82%~98%之间；山东省 NDV 病毒库 21 株毒株之
间核苷酸同源性在 92%～99.9%之间，氨基酸同源性在 95%～100%之间。同源关系进
化树表明强毒株与标准株 LaSota 距离较近，强、中弱毒株在进化树上明显分为不同
类别。菌种资源收集合理并具有代表性，资源平台能够充分刻画山东省 NDV 特性。
对分离的各种资源进行标准化整理整合，分别完成《资源描述表》和《共性描述
规范表》，并进行菌种的冻干保存送交国家兽医微生物菌种保藏管理中心国家兽医微
生物标准菌种保藏库保存，将各个相关的数据录入中国兽医微生物资源信息网的数据
库，并实现与 E-平台的衔接。
关键词：山东省；兽医微生物；菌种资源库；新城疫病毒；建立；评价

目录
摘要 ........I
Abstract ..III
英文缩略表 .......... V
第一章 绪论 ......... 1
1 研究目的和意义 ... 1
2 国内外研究进展 ... 1
2.1 菌种资源平台的定义 ........ 1
2.2 国外菌种资源的研究进展  2
2.3 国内菌种资源的研究进展  5
2.4 我国兽医微生物菌种的研究进展  6
2.5 山东省常见兽医微生物及其资源  8
第二章 山东省兽医微生物细菌库资源平台的建立 ... 10
1 研究内容与技术路线 ..... 10
2 材料与方法 ......... 11
2.1 关键试剂与仪器 .. 11
2.2 病料的采集 .......... 12
2.3 细菌的分离鉴定 .. 13
2.4 特殊菌种的采集与鉴定 .. 16
2.5 菌种的冻干与保存 .......... 16
2.6 菌种信息的标准化整理与整合 .. 16
3 结果与分析 ......... 17
3.1 山东省常见兽医微生物的分离鉴定 ...... 17
3.2 山东省特殊兽医微生物的分离鉴定 ...... 20
3.3 菌种信息的标准化整理与细菌库的建立 .......... 21
4 讨论 ......... 24
4.1 细菌资源库建立的要素 .. 24
4.2 本研究建立的细菌资源库特点 .. 25
第三章 山东省新城疫病毒资源平台的建立及评价 ... 27
1 研究内容与技术路线 ..... 27
1.1 研究内容 .. 27
1.2 技术路线 .. 28
2 材料与方法 ......... 28
2.1 关键试剂与仪器 .. 28
2.2 病毒的采集与分离纯化 .. 29
2.3 NDV 的常规生物学特性鉴定...... 30
2.4 NDV 的分子生物学鉴定——RT-PCR 鉴定 ...... 31
2.5 病毒信息的标准化整理与整合 .. 33
2.6 NDV HN 基因克隆与序列分析... 33
3 结果与分析 ......... 37
3.1 NDV 分离与鉴定.. 37
3.2 山东省 NDV 病毒资源的标准化整理及病毒库的建立 39
3.3 山东省 NDV 病毒库的评价——HN 基因克隆与序列分析 ..... 42
4 讨论 ......... 46
4.1 病毒资源库建立的要素 .. 46
4.2 本研究建立的病毒资源库特点 .. 47
第四章 总体结论 ........... 48
1 论文总体结论 ..... 48
2 本研究创新点 ..... 48
3 有待进一步研究的问题 . 49
参考文献 . 50
附录 . 54
附录一 山东省兽医微生物常见细菌库菌种资源描述表和共性描述规范表（示例） ........... 54
附录二 山东省兽医微生物特殊细菌库菌种资源描述表和共性描述规范表（示例） ........... 57
附录三 新城疫病毒测序峰图（部分） ... 74
致谢 . 78

图表目录
表 2-1. 山东省细菌库大肠杆菌种资源描述表（示例） ........ 21
表 2-2. 山东省细菌库大肠杆菌种资源共性描述规范表（示例） .... 23
表 3-1. NDV 分子鉴定 RT-PCR 反应体系....... 32
表 3-2. NDV 毒种资源描述表（示例） ........... 40
表 3-3. NDV 资源共性描述规范表（示例） ... 41
表 3-4. 山东省 NDV 病毒库强中弱毒株与标准株 HN 基因核苷酸同源性比较...... 44
表 3-5. 山东省 NDV 病毒库 21 株之间 HN 基因核苷酸同源性比较 44
表 3-6. 山东省 NDV 病毒库 21 株之间 HN 基因氨基酸同源性比较 45
图 2-1. 山东省兽医微生物细菌库建立技术路线 ........ 11
图 2-2. 山东省细菌资源库采样分布图  12
图 2-3. 山东省细菌资源库——大肠杆菌镜检照片 .... 18
图 2-4. 山东省细菌资源库——金黄色葡萄球菌镜检照片 .... 19
图 2-5. 山东省细菌资源库——猪链球菌镜检照片 .... 20
图 2-6. 山东省细菌资源库——鸡伤寒沙门氏菌镜检照片 .... 21
图 3-1. 山东省新城疫病毒库平台建立及评价技术路线 ........ 28
图 3-2. PGEM-T Easy 载体环形结构图及序列参考位点 ....... 34
图 3-3. 60 株 NDV 的血凝-血凝抑制效价分布情况 .... 37
图 3-4. 60 株 NDV 的 MDT 分布情况 .. 38
图 3-5. 60 株 NDV 的 ICPI 分布情况 ... 38
图 3-6. NDV 毒株的 RT-PCR 特异性试验结果........... 39
图 3-7. NDV 病毒库信息资源描述 ....... 42
图 3-8. NDV HN 基因扩增效果  43
图 3-9. HN 基因阳性质粒的鉴定 .......... 43
图 3-10. 山东省 NDV 病毒库 21 株之间 HN 基因核苷酸同源关系进化树.. 46
图 3-11. 山东省 NDV 病毒库 21 株之间 HN 基因氨基酸同源关系进化树.. 46