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资料简介
硕士论文-花生体细胞杂交法的基础研究,共59页,33481字
摘 要
花生(Arachis hypogaea L.)是我国重要的油料作物和经济作物之一。但由于花生
栽培种遗传基础狭窄、抗逆性差、易感多种病虫害,严重影响其产量和品质。花生属野
生种具有抗旱、耐贫瘠、抗病虫性强等优良性状。但在常规条件下,花生栽培种与多数
野生种杂交不亲和,影响这些野生种的有效利用。体细胞杂交法能克服杂交不亲和性,
将野生种的优良基因导入花生栽培种中。本论文进行了花生体细胞杂交法的基础研究。
首先以花生幼叶为外植体,建立了高频率植株再生体系;以此体系为培养基础对花生原
生质体分离、融合及培养条件进行了研究,结果如下:
1. 以花生品种白沙 1016、花育 23 和花育 22 的成熟种胚萌发 5~7d 的幼叶为外植体,
对不定芽诱导及植株再生条件进行了研究。结果表明:愈伤组织诱导培养基及再分化培
养基中添加的激素及其浓度对不定芽分化及植株再生有显著影响,愈伤组织诱导培养基
以 MSB5+1 mg/L NAA+ 6 mg/L BAP、再分化培养基以 MSB5+4 mg/L BAP 最有利于不定
芽诱导及植株再生,白沙 1016、花育 23 和花育 22 幼叶外植体先后在上述培养基上培养,
不定芽诱导率分别达到 91.8%、88.5%和 78.2%。
2. 以 7 个花生品种的幼叶为外植体,对花生体细胞胚诱导及植株再生条件进行了研
究。结果表明:不同基因型,其最适合的体胚诱导培养基及体胚诱导率(20.0~90.6%)
不同,花育 23、鲁花 7、鲁花 16 和 Krapst 在添加 20 mg/L 2,4-D 的培养基上获得较高
的体胚诱导率,而白沙 1016 在添加 5 mg/L 2,4-D 的培养基上获得较高的体胚诱导率,
其中 Krapst 的体胚诱导率最高,达到 90.6%;将体细胞胚转到萌发培养基上,培养基中
添加 4 mg/L BAP 有利于体胚的萌发及植株再生,不添加 BAP 则有利于生根;不同基因
型,其植株再生率(15.7%~80.5%)也不同,白沙 1016 最高,达到 80.5%。
3. 对花生原生质体分离、融合及培养条件进行研究。结果表明:以花育 22 幼叶外
植体为材料解离原生质体,在 2% Cellulase Onozuka R-10、1%Macerozyme R-10 的酶溶
液中最佳酶解时间是 20h,原生质体的产量和活力均较高;酶溶液中添加抗氧化剂提高
了原生质体的产量和活力,以添加 10 g/L PVP 或 100~150 mg/L ASA 最有效;利用固液
双层培养法,提高了原生质体植板率及微愈伤形成率;以葡萄糖代替蔗糖可促进细胞分
裂;培养基中添加不同的抗氧化剂对原生质体分裂及微愈伤形成有重要影响,以添加柠
檬酸效果最好,提高了细胞的分裂率及微愈伤形成率,PVP 和 ASA 的效果次之,活性
炭最差;基因型对花生原生质体培养也有影响,以花育 23 的原生质体分裂率和微愈伤
形成率最高;利用 PEG 法,对花生与其近缘野生种 A. pusilla 或 A. stenosperma 进行了
细胞融合及培养,并形成直径 2 mm 的微愈伤。
关键词:花生(A. hypogaea L.);组织培养;原生质体分离;原生质体培养;细胞
融合;抗氧化剂;植株再生
目 录
摘 要 i
Abstract .........iii
缩略词表......... v
前 言............... 1
1 立题依据及意义.......... 1
2 文献综述..... 2
2.1 花生组织培养与植株再生的研究进展 .. 2
2.1.1 花生组织培养的发展概况 .... 2
2.1.2 器官发生途径获得再生植株 ............... 3
2.1.3 胚胎发生途径获得植株再生 ............... 4
2.2 花生属近缘野生种的优点及其应用前景 ............... 5
2.2.1 花生属植物的组系划分 ....... 5
2.2.2 花生属野生植物的种质多样性 ........... 5
2.2.3 花生属野生植物所具有的优异种质与应用前景 ............... 6
2.3 植物原生质体培养研究进展 ... 6
2.3.1 植物原生质体培养发展概述 ............... 6
2.3.2 原生质体的分离.... 7
2.3.3 原生质体的纯化.... 8
2.3.4 原生质体培养........ 9
2.4 植物体细胞杂交法研究进展 . 11
2.4.1 种间杂交不亲和性及其表现 .............. 11
2.4.2 克服种间杂交不亲和性的方法 .......... 11
2.4.3 体细胞杂交法研究进展 ...... 11
2.4.4 诱导体细胞融合的方法 ...... 12
2.5 花生原生质体培养及细胞融合的研究进展 ......... 13
材料与方法... 14
1 花生幼叶不定芽分化及植株再生 ........... 14
1.1 植物材料 14
1.2 试验方法 14
1.2.1 基本培养基和培养条件 ..... 14
1.2.2 外植体的制备..... 14
1.2.3 愈伤组织的诱导.. 14
1.2.4 不定芽的分化..... 14
1.2.5 植株再生及驯化移栽 ......... 14
2 花生幼叶体细胞胚诱导及植株再生 ....... 16
2.1 植物材料. 16
2.2 试验方法 16
2.2.1 基本培养基和培养条件 ..... 16
2.2.2 体细胞胚的诱导. 16
2.2.3 体细胞胚的萌发及植株再生 ............. 16
3 花生原生质体分离、融合及培养 ........... 16
3.1 植物材料 16
3.2 酶液组成 17
3.3 原生质体的分离与纯化 ........ 17
3.3.1 原生质体的分离.. 17
3.3.2 原生质体的纯化.. 17
3.3.3 原生质体活性测定.............. 17
3.3.4 原生质体产量测定.............. 17
3.4 原生质体培养......... 18
3.5 原生质体融合........ 18
结果与分析... 22
1 花生幼叶不定芽分化及植株再生............ 22
1.1 诱导培养基中 NAA 和 BAP 浓度对幼叶外植体不定芽诱导的影响 22
1.2 分化培养基中 BAP 浓度对幼叶外植体不定芽分化及植株再生的影响 .......... 23
1.3 植株再生及驯化移栽............. 24
2 花生幼叶体细胞胚诱导及植株再生 ....... 24
2.1 2,4-D 浓度对幼叶外植体体细胞胚诱导的影响... 24
2.2 体胚萌发及植株再生............. 25
2.3 基因型对花生幼叶外植体体胚诱导及植株再生的影响 .... 27
3 花生原生质体分离、融合及培养 ........... 28
3.1 酶解时间对花生原生质体的影响 ......... 28
3.2 酶液中添加不同浓度 PVP 对花生原生质体的影响 .......... 29
3.3 酶液中添加不同浓度 ASA 对花生原生质体的影响 .......... 30
3.4 不同碳源对原生质体培养的影响 ......... 30
3.5 不同培养方式对花生原生质体培养的影响 ......... 31
3.6 培养基中添加不同抗氧化剂对原生质体培养的影响 ........ 32
3.7 基因型对花生原生质体培养的影响 .... 33
3.8 融合原生质体的培养及愈伤组织的形成 ............ 33
讨 论............. 34
1 花生幼叶不定芽再生途径的研究 ............ 34
1.1 诱导培养基对不定芽分化的影响 ......... 34
1.2 分化培养基对植株再生的影响 ............. 34
2 花生幼叶胚胎发生途径的研究 34
2.1 2,4-D 浓度对体细胞胚诱导的影响....... 34
2.2 体胚萌发及植株再生............. 35
3 花生原生质体分离、融合及培养 ........... 35
3.1 酶解时间对花生原生质体产量和活力的影响 ..... 35
3.2 抗氧化剂对原生质体分离的影响 ......... 36
3.3 不同碳源对原生质体培养的影响 ......... 36
3.4 不同培养方式对原生质体培养的影响 . 36
3.5 培养基中添加不同抗氧化剂对原生质体培养的影响 ......... 37
3.6 基因型对花生原生质体培养的影响 .... 37
3.7 花生与其近缘野生种间原生质体融合及培养 .... 37
结 论............. 38
1 花生幼叶不定芽再生体系的建立 ............ 38
2 花生幼叶体细胞胚再生体系的建立 ........ 38
3 花生原生质体分离、融合及培养 ........... 38
参考文献....... 40
致 谢..............45
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