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天津医科大学硕士研究生毕业论文 铁代谢及Nrf2/ARE通路在老化小鼠脊髓中的改变 共47页，17458字
目录
中文摘要……………………………………………………1
英文摘要……………………………………………………5
研究论文 铁代谢及Nrf2/ARE通路在老化小鼠脊髓中
的改变
前言……………………………………………………11
材料与方法……………………………………………12
结果……………………………………………………18
附图……………………………………………………19
讨论……………………………………………………21
参考文献………………………………………………28
综述 铁代谢，氧化应激与老化………………………31
致谢…………………………………………………………44

摘要
“老化”是活的有机体逐渐经受有害的改变的过程,随着机体的老化，最终会导致结构的破坏，功能的下降，增加疾病或死亡的可能性。已经有很多文献报导很多神经变性疾病与老化有关，包括阿尔茨海默病，帕金森病，运动神经元病等。然而在老化进程中其确切的分子机制是不清楚的，已经有大量证据证实在老化和中枢神经系统退行性病变中存在氧化应激和铁的异常沉积。通过了解中枢神经系统老化的进程和机制可以帮助我们进一步理解这些相关疾病的临床表现和进展。
铁是人体最丰富的微量元素，由于其独特化学反应活性，在维持细胞和机体的正常代谢过程中起着至关重要的作用，如氧的输送、线粒体的氧化反应、神经递质和DNA合成等。然而，自由铁能通过Fenton反应生成具有高度反应性的羟自由基，导致氧化应激，从而损害机体的一些基本成分，如脂质，蛋白，DNA等，导致细胞损伤。所以维持机体内铁的平衡对于机体是非常重要的。在脑外，细胞与组织的铁平衡主要取决于两种蛋白：铁蛋白(ferritin)和转铁蛋白受体(transferrin receptor，TfR)，这两种蛋白的表达受细胞内铁的控制，细胞内铁浓度发生变化时，机体有能力通过细胞质内的铁调节蛋白(iron regulatoryprotein，IRP)和TfR及Ferritin mRNA上的铁反应元件(iron response element，IRE)结合的变化来调节这二种蛋白的表达，进而使细胞内铁保持在正常水平。铁减少时TfR表达增加而Ferritin表达减少，反则反之。已经证实，脑内也存在TfR和Ferritin，两者在脑内同样受控于IRP/IRE调节。
在老化过程中氧化应激(oxidative stress)起重要作用。氧化应激是指体内的自由基及其产物超过了机体的抗氧化防御机制的一种病理状态，它通常是由于体内的自由基显著增高和/或机体的抗氧化防御功能下降所致。Nrf2/ARE系统是抵抗各种环境应激和内源性应激防御机制中必不可少的部分。Nrf2是具有基本亮氨酸拉链结构的一种核转录因子，正常情况下存在于胞浆内，Keap1蛋白可以特异的结合在Nrf2的氨基端，使Nrf2的活性受到抑制。当诱导剂存在的情况下，Nrf2磷酸化，向细胞核内转移，磷酸化的Nrf2进入核内后，通过P38/ERK/JNK途径与Maf蛋白形成异二聚体，并与antioxident response element (ARE)结合。ARE被称为抗氧化反应元件，是顺式作用元件的一段增强子序列。在许多解毒酶、抗氧化酶如：GST、NQO1、HO-1的基因序列中都存在ARE序列，因此，ARE介导细胞内参与氧化应激的基因转录水平的激活，Nrf2 /ARE信号的增强表达，上调多种抗氧化酶、解毒酶的表达，强力升高细胞的抗氧化和解毒能力。其中血红素氧合酶(heme oxygenase ,HO)是哺乳动物组织细胞微粒体的一种蛋白酶，催化血红素产生胆绿素、一氧化碳(CO) 和铁，胆绿素再形成胆红素，二者是体内强有力的自由基清除剂。CO作为一种重要的细胞信息分子，在细胞功能和通讯的调节中也发挥重要的信号转导作用。HO是进化上高度保守的基因，但两种同工酶(HO-1、HO-2)基因的定位、结构及调控明显不同。HO-1为诱导型，各种刺激、低氧、血红素、过渡金属、NOSs的一些诱导因子如LPS和细胞因子等都可以诱导HO-1的表达，提高细胞的抗氧化能力，发挥细胞保护作用。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate,NADPH)：醌氧化还原酶1(NQO1)是绝大多数真核生物细胞中普遍存在的一种黄素蛋白酶，主要存在于细胞质，但微粒体、线粒体、高尔基体中均可检测到该酶的活性。NQO1酶在胞内属于Ⅱ相解毒酶，能够借助NADH或NADPH作为电子供体，催化体内的醌类化合物的还原反应，从而对醌类物质的损伤形成一种保护机制。NQO1参与维生素E介导的抗氧化反应，使细胞抗氧化剂维生素E保持还原状态。NQO1能够充当辅酶Q(泛醌)的还原酶，使其保持在还原状态从而保护细胞膜组织不被氧自由基损伤。
目的：本实验用ICR小鼠作为研究对象，研究不同时期小鼠脊髓中铁蛋白重链，转铁蛋白受体及Nrf2,HO1,NQO1的变化，进一步理解中枢神经系统老化的进程和机制，有助于我们理解这些相关疾病的临床表现和进展。
方法：
1、实验分组 分三组：分别为1个月，5个月，13个月的雄性ICR小鼠，每组6只，共18只。
2、取材 新鲜取材：用10%的水合氯醛麻醉小鼠,迅速断头，取出脊髓，液氮冷冻，然后-80℃保存。
3、目的蛋白的测定 用试剂盒提取脊髓中的蛋白，测定总蛋白的浓度，计算出100g所需要蛋白的μl数。进行SDS-PAGE电泳，100V恒压转膜2小时，5%脱脂奶粉封闭1小时，加入一抗4℃过夜，二抗避光孵育2小时， Odyssey Infrared Imaging System 检测，并计算出目的条带与β-actin的比值。
4、统计分析 实验结果以均值+标准差( ±s)表示，采用SAS V8软件进行统计分析，组间比较采用方差分析，统计结果以P﹤0.05为有显著差异。
结果：
1、随着年龄的增长，小鼠脊髓中铁蛋白重链蛋白表达水平上调，转铁蛋白受体蛋白表达水平下调。与1个月的和5个月的小鼠相比，13个月的小鼠的脊髓中铁蛋白重链蛋白表达水平升高(P﹤0.05)，5个月和1个月的相比也有升高趋势，但没有统计学意义。与1个月的小鼠相比，5个月和13个月的小鼠的脊髓中的转铁蛋白受体蛋白表达水平下降(P﹤0.05)，5个月和13个月的小鼠相比没有统计学意义。
2、随着年龄的增长，小鼠脊髓中Nrf2 /ARE系统蛋白表达水平下调。与5个月的小鼠相比，13个月的小鼠的脊髓中Nrf2蛋白表达水平下降(P﹤0.05)，其余各组间相比没有统计学意义。与1个月的小鼠相比，5个月和13个月的小鼠的脊髓中HO-1蛋白表达水平下降(P﹤0.05)，其余各组间相比没有统计学意义。NQO1各组间相比没有统计学意义。
结论：在老化的小鼠的脊髓中铁蛋白水平上调，转铁蛋白受体水平下调，推测这是机体对铁过载的保护性反应。Nrf2，HO-1水平下调，这是机体抗氧化能力下降的标志。说明在老化的小鼠脊髓中存在铁代谢紊乱和氧化应激。
关键词：老化；铁；铁蛋白；转铁蛋白受体；氧化应激；Nrf2；血红素氧合酶氧合酶1；NADPH醌氧化还原酶1。