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资料简介

毕业论文-基于attL/R重组系统的细菌基因组杂交与整合初步探究,共60页,19853字
中文摘要
以最小基因组为底盘,结合模块化的生物元件,实现细胞―微工厂 ‖的设计、
改造,是合成生物学的重要目标之一。模块的生物元件基因容量在几十到上百
Kbp,而基因组更是达到 Mbp 数量级。大片段基因水平上的操作将是合成生物学
的关键技术。本课题目标在于研究通过基因组杂交的方法实现将一个菌种的基因
组部分片段插入到另一个细菌的基因组中,实现基因组整合。
本课题中利用转座子 Tn5 将特异性位点重组片段 attL1 和 attL2 分别插入受体
菌(嗜水气单胞菌 4AK4)基因组,将对应重组位点 attR1R2 插入大肠杆菌。其
中嗜水气单胞菌作为基因组供体菌,插入的 attL1 和 attL2 相距约 1Mbp,而大肠
杆菌作为基因组受体菌,attR1R2 随机插入基因组。将得到的嗜水气单胞菌和大
肠杆菌原生体融合,同时表达重组酶 Int 和 Xis,使 attL1/attR1 和 attL2/attR2 分
别发生重组,从而将 attL1、attL2 之间的大片段基因插入大肠杆菌基因组,得到
杂交新菌株,此方法称为基因组杂交和整合。利用此方法,我们甚至有可能将供
体菌基因组全部逐步的插入到受体菌基因组中。
本论文成功的构建了自杀质粒 pTn5-attL1, pTn5-attL2 和 pTn5-attR1R2 用于
将 attL/R 等重组位点插入细菌基因组。通过大肠杆菌 S17-1 作为接合转化中间宿
主,成功地将 attL2 插入嗜水气单胞菌基因组(称之为 4AK4-L2);通过化学转化
将 attR1R2 插入大肠杆菌 DH5α 基因组,并进行 TAIL-PCR 确定这些片段的具体
插入位点。attL1 可以插入 4AK4-L2 基因组,但细胞中存在 pTn5-attL1 质粒,这
些问题需要进一步探究。这些工作为实现两种菌株的基因组整合打下了基础。
关键词:大片段基因组转化; 基因组杂交; 原生质体融合; 嗜水气单胞菌,大肠杆菌

ABSTRACT
One of the aims of synthetic biology is to build cell microfactories with special
properties, utilizing the minimal genome as basis and the biological parts as bricks.
The size of biobrick count to the scale of tens of kbp to hundreds of kbp, and the
genome is even larger. Operation on the large fragment genes is going to one of the
major technology in synthetic biology.
The aim of this project is to insert partial genome of Aeromonas hydrophila
4AK4 (donor), into the genome of E. coli (recipient) by protoplast fusion, resulting a
new strain with combinational genotype and phenotype of both the donor and recipient
cells. Site-specific recombination sites attL1 and attL2 are randomly inserted into the
donor genome with a distance of about 1Mb by Tn5 transposon, and attR1-attR2 are
inserted into the recipient genome using the same method. With the expression of
phage integrase (Int) and excisionase (Xis) in E. coli after protoplast fusion,
site-specific recombination occurs between attL1/attR1 and attL2/attR2, respectively,
inserting the large part of genome between attL1 and attL2 in A. hydrophila 4AK4
genome into the genome of E. coli. This process is called genome hybridization. Using
this method, we might eventually assembly the whole donor genome into the recipient
genome, thus combining two strains to one.
In this study, we successfully constructed three suicide plasmid s pTn5-attL1,
pTn5-attL2 and pTn5-attR1R2 for inserting attL/R into the bacterial genomes. We
succeeded in inserting attL2 into A.hydrophila 4AK4 (called 4AK4-L2) and attR1R2
into E. coli, and the loci are determined by TAIL-PCR. While attL1 was inserted into
the genome of 4AK4-L2, plasmid pTn5-attL1 existed in the cell. The reason of this
phenomenon needs more investigation.
Keywords: large genomic fragment transfer; genome hybridization; protoplast
fusion; Aeromonas hydrophila 4AK4; Escherichia coli

目录
第 1 章 引 言 1
1.1 合成生物学1
1.1.1 合成生物学简介 .1
1.1.2 合成生物学研究进展 1
1.2 大片段基因导入宿主细胞....2
1.2.1 基因转化 ......2
1.2.2 细菌原生质体融合 ....3
1.3 attL/R 位点特异性重组...3
1.4 Tn5 转座子 .5
1.5 热不对称交错(TAIL)PCR5
1.5.1 TAIL-PCR 原理 ..6
1.5.2 TAIL-PCR 引物设计 ..7
1.6 论文目标及意义......7
第 2 章 实验材料与方法..8
2.1 主要材料....8
2.1.1 菌种 8
2.1.2 质粒 8
2.1.3 常用生化试剂 .....9
2.1.4 分子生物学常用酶及其它试剂(盒) 9
2.1.5 DNA 分子量标准 .....10
2.1.6 常用缓冲液 10
2.1.7 仪器设备 .... 11
2.1.8 LB 培养基及抗生素的制备 ... 11
2.1.9 常用抗生素的制备 ..12
2.2 分子生物学实验操作方法..12
2.2.1 标准分子实验方法 ..12
2.2.2 PCR 扩增反应....12
2.2.3 TAIL-PCR....13
2.2.4 DNA 酶切反应 ..16
2.2.5 载体与目的片段的连接 .17
2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化方法 .17
2.2.7 E. coli S17-1 介导的接合转化(conjugation)方法 .....18
2.3 细菌的培养与保存19
2.3.1 细菌培养 ....19
2.3.2 菌种保存 ....19
2.4 生物实验软件及网络资源..19
第 3 章 实验结果与讨论20
3.1 pTn5-attL1, pTn5-attL2, pTn5-attR1R2 等质粒的构建 20
3.1.1 attL1,attL2、attR1R2 重组位点序列的合成 ..21
3.1.2 PCR 反应扩增抗性基因并插入合成的 attL/R 序列旁 ..22
3.1.3 tnpA 构建 ....23
3.1.4 pTn5-attL1, pTn5-attL2 ,pTn5-attR1R2 等质粒的构建与验证.....24
3.2 重组位点 attL2 插入 4AK4 基因组..27
3.2.1 接合转化验证 pTn5-attL2 功能 ...28
3.2.2 attL2 插入 4AK4 基因组 .28
3.2.3 TAIL-PCR 确定 attL2 在 4AK4 基因组插入位点 ..29
3.3 重组位点 attL1 插入 4AK4-L2 基因组 ...32
3.3.1 pTn5-attL1 导入 4AK4-L2 .....32
3.3.2 无 pTn5-attL1 质粒的 4AK4-L2-L1 进一步探究...32
3.3.3 小结 .....35
3.4 attR1R2 插入大肠杆菌基因组....35
3.4.1 pTn5-attR1R2(tetr)导入大肠杆菌 ...35
3.4.2 pTn5-attR1R2-chlr 化转导入 E.coli DH5α .35
3.4.3 TAIL PCR 确定 attR1R2 在 E.coli DH5α 插入位点 36
第 4 章 结 论....38
插图索引 .....39
表格索引 .....41
参考文献 .....42
致 谢 ....44
声 明 .... 错误!未定义书签。
附录 A 外文资料的调研阅读报告 .....46

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