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硕士论文-猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及DNA疫苗的初步研究，共63页，34065字
摘要
1.本研究采集 PRRS 疑似病料，在 Marc-145 细胞上进行病毒分离，盲传 3 代，出现
细胞病变。根据 GenBank 中 PRRSV 美洲株保守 N 基因序列设计合成了一对引物，利用
RT-PCR 方法从分离毒株细胞培养物中扩增出大小约 374bp 片段。病毒在 Marc-145 细胞
上培养 36h 后做免疫荧光试验（IFA），出现明显的绿色荧光。证明分离到一株 PRRSV 毒
株。
2.根据 GenBank 数据库中的 PRRSV VR2332 毒株 GP5 的基因序列，设计合成了两对
引物，针对 GP5 蛋白的含有 BamHI 和 EcoRI 酶切位点的引物 p1/p2 和针对 GP5 蛋白非中
和表位缺失含有 HindIII、EcoRI 酶切位点的引物 tGP5.1/tGP5.2，RT-PCR 扩增 GP5 基
因和 tGP5 基因的 DNA 序列，克隆于真核表达载体 pcDNA3.1 中，经 PCR、酶切鉴定及 DNA
序列测定，表明插入的片段具有正确的阅读框，同时证明分离毒株为美洲株。
3. pcDNA3.1、真核重组质粒 pcDNA3.1-GP5 和 pcDNA3.1-tGP5 用 Lipofectamine2000
转染 Marc-145，于 37℃ 5%CO2 培养细胞 48h，提取总 RNA 做 RT-PCR，结果 pcDNA3.1-GP5
转染孔在 603bp 处出现目的条带，pcDNA3.1-tGP5 转染孔在 495bp 处出现目的条带，表
明两个重组质粒在细胞中得到转录。同时对转染孔做免疫荧光试验，转染 pcDNA3.1-GP5、
pcDNA3.1-tGP5 质粒的细胞均出现明显荧光，证明重组质粒在 Marc-145 中得到有效表
达。
4. 用 TIANGEN 公司质粒大提试剂盒大提质粒 pcDNA3.1-GP5,pcDNA3.1-tGP5 和空载
体 pcDNA3.1，将三种质粒及 PBS 免疫小鼠 4 次，每次间隔 2 周，每次免疫后两周用 ELISA、
病毒中和试验检测抗 PRRSV 抗体。结果表明 pCDNA3.1-GP5 和 pCDNA3.1-tGP5 均能在小
鼠体内有效诱导 ELISA 抗体和中和抗体，从而为进一步发展有效的疫苗、为 PRRS 的防
制提供了一定的指导意义。
关键词：PRRSV；病毒分离；GP5；中和表位
目录
摘要........I
ABSTRACT........... II
符号说明.III
前言....... 1
第一部分 文献综述 2
1 PRRSV 的流行病学研究 .......... 2
2 PRRSV 分子生物学研究 ........... 4
3 免疫学的研究............. 9
4.中和抗体在 PRRSV 保护性免疫中的作用 .......... 10
5 预防 PRRSV 感染的疫苗研究 11
第二部分 试验研究............. 13
试验一 猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定............ 13
1.试验材料..... 13
2.方法............. 13
3.结果与分析. 16
4 讨论............ 18
试验二 PRRSV GP5 与 tGP5 基因克隆及其真核表达载体的构建 ........... 20
1.试验材料..... 20
2.方法............. 20
3.结果............. 25
4 讨论............ 29
试验三 pcDNA3.1-GP5 和 pcDNA3.1-tGP5 在 Marc-145 细胞中的表达 .............. 30
1.材料............. 30
2 方法............ 30
3.结果............. 33
4.讨论............. 35
试验四 PRRSV GP5 蛋白非中和性表位缺失对其免疫应答的影响 ......... 36
1.试验材料..... 36
2.方法............. 36
3 结果............ 39
4 讨论............. 41
全 文 总 结.......... 43
参考文献. 44
附 录
溶液的配制............. 50
致谢......... 53