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硕士论文-农杆菌介导的几丁质酶基因转化花生的研究，共57页，29146字
摘 要
花生（Arachis hypogaea L.）是我国重要的油料作物和经济作物之一，但由于花生
遗传基础狭窄、抗逆性差，易感多种病虫害，尤其是褐斑病、黑斑病、网纹斑病等真菌
性病害，严重影响其产量和质量。本论文以广谱抗真菌性的几丁质酶基因为目的基因进
行了花生遗传转化研究。首先以花生幼叶为外植体，建立了高频率植株再生体系；以此
体系为培养基础对农杆菌介导的遗传转化条件进行了研究，并获得了转基因植株。结果
如下：
1. 以花生品种花育 20 和白沙 1016 成熟种子萌发 5-7 d 的幼叶为外植体，对不定芽
诱导和体细胞胚胎发生及其植株再生条件进行了研究。结果表明：⑴不定芽诱导及植株
再生试验中，MSB5+ 1 mg/L NAA+ 6 mg/L BAP 最有利于不定芽的诱导，花育 20 和白沙
1016 不定芽诱导率分别达到 87.5%和 91.7%；当转移到 MSB5 + 4.0 mg/L BAP 培养基上
培养，能促使芽伸长，并获得了较高植株再生频率；在添加 0.5 mg/L NAA 的培养基上
生根效果较好。⑵ 体细胞胚胎发生及植株再生试验中，花育 20 在添加 10 mg/L 2,4-D
培养基上体细胞胚诱导率最高,为 70.8%，白沙 1016 在添加 15 mg/L 2,4-D 培养基上诱导
率最高,达到 85.0%；MSB5 + 4.0 mg/L BAP 有利于促进体细胞胚萌发和植株再生。
2. 以花育 20 和白沙 1016 幼叶为受体材料，对农杆菌介导的花生遗传转化条件进
行了研究。农杆菌菌株为 GV3101，质粒为双元表达载体 pCH5B1300，以 Km 作为抗性
筛选标记，T-DNA 区有几丁质酶基因。首先进行了不同 Km 浓度（0，50，75，100mg/L）
抑制外植体形成不定芽的试验，结果表明 75 mg/L 能完全抑制不定芽的形成。因此，确
定 Km 筛选压为 75 mg/L。研究了不同预培养时间（0，1，2，3 d）、侵染时间（5，10，
15，20 min）、共培养时间（2，3，4，5 d）对遗传转化的影响，结果表明，外植体经过
预培养 2 d，在农杆菌中侵染 15 min，共培养 3 d，为适宜的遗传转化条件。当转移到
MSB5+ 1 mg/L NAA+ 6 mg/L BAP + 75 mg/L Km 的不定芽诱导培养基上培养，抗性芽诱
导率最高。
3. 将抗性芽转移到 MSB5 + 4.0 mg/L BAP + 75 mg/L Km 的培养基上培养，促使芽
伸长，长成小苗。对抗性植株进行 PCR 检测，扩增出了与目的基因大小相同的条带，
表明几丁质酶基因已转入花生。
关键词：花生（A. hypogaea L.）；遗传转化；根癌农杆菌；几丁质酶基因（CH5B）
目 录
中文摘要.... ..ⅰ
英文摘要........ⅱ
缩略词............ⅳ
前言....... ........ .1
1 立题依据及意义........... . .............1
2 文献综述.......... ...... ....2
2.1 花生组织培养与植株再生的研究进展 ......... .......2
2.1.1 器官发生途径获得植株再生........ .......... ..........2
2.1.2 胚胎发生途径获得植株再生. ........... 3
2.2 花生遗传转化研究现状.... .... 4
2.2.1 农杆菌介导法. ... 4
2.2.2 基因枪法.. .......... 6
2.2.3 电击穿孔法.. ...... 6
2.2.4 花粉管通道法..... ............... 6
2.3 几丁质酶作用及其研究进展.... ............ 7
2.3.1 几丁质酶的结构及分类.... 7
2.3.2 几丁质酶在植物抗病中的作用........ 8
2.3.3 转几丁质酶基因研究进展.............. .. 9
材料与方法........... ....... 11
1 花生幼叶组织培养及植株再生... ........... 11
1.1 植物材料.... .......... 11
1.2 试验方法....... ....... 11
1.2.1 基本培养基和培养条件. . 11
1.2.2 外植体的制备.... .............. 11
1.2.3 不定芽诱导及其植株再生. ............. 11
1.2.3.1 不定芽的诱导........... ... 11
1.2.3.2 不定芽的伸长........... ... 11
1.2.3.3 生根培养........... ........... 11
1.2.4 体细胞胚发生及其植株再生...........12
1.2.4.1 体细胞胚的诱导........... ............... 12
1.2.4.2 体细胞胚的萌发及植株再生.. .... 12
2 农杆菌介导的花生遗传转化的研究............ .......... 13
2.1 试验材料.............. 13
2.1.1 植物材料.......... 13
2.1.2 菌株和质粒...... 13
2.1.3 培养基.............. 13
2.1.4 试剂配制.......... 13
2.1.4.1 抗生素的配制........ ...... 13
2.1.4.2 质粒提取所需试剂........ .............. 14
2.1.4.3 植物基因组提取试剂...... ............ 14
2.1.4.4 DNA 电泳所需试剂............ ........... 14
2.2 试验方法............... ............... 14
2.2.1 农杆菌质粒 DNA 的提取........ .......... 14
2.2.2 表达载体的 PCR 检测.......... ............ 15
2.2.3 农杆菌活力曲线的测定.. 15
2.2.4 花生的遗传转化.... .......... 15
2.2.4.1 Km 筛选浓度的确定......... .............. ..............15
2.2.4.2 抑菌抗生素（Cb）浓度的筛选.... .............. 16
2.2.4.3 侵染用农杆菌菌液的制备... ....... 16
2.2.4.4 遗传转化与抗性植株再生..... ............. ........16
2.2.5 花生基因组 DNA 的提取............... . ..16
2.2.6 转化植株的 PCR 检测. ... 17
结果与分析. . 18
1 花生幼叶组织培养植株再生体系的建立. .............. 18
1.1 不定芽诱导及其植株再生. . 18
1.1.1 不同浓度 NAA 和 BAP 对幼叶外植体不定芽诱导的影响........... ... 18
1.1.2 不同浓度 BAP 对不定芽伸长及植株再生的影响......... . 19
1.1.3 不同激素对植株生根的影响. ......... 20
1.2 体细胞胚发生及其植株再生. ............. 20
1.2.1 不同浓度 2,4-D 对体细胞胚诱导的影响. ..... 20
1.2.2 体细胞胚的萌发及植株再生. ......... 21
2 农杆菌介导的花生遗传转化条件研究. .. 23
2.1 植物表达载体的鉴定. ......... 23
2.1.1 农杆菌质粒 DNA 的提取. . 23
2.1.2 表达载体的 PCR 检测. ..... 23
2.2 农杆菌 GV3101 活力曲线的测定........ 24
2.3 Km 筛选浓度的确定............. 25
2.4 抑菌抗生素（Cb）浓度的确定.......... 26
2.5 不同转化条件对抗性芽诱导的影响........ .......... 27
2.5.1 预培养时间的影响....... . ..27
2.5.2 侵染时间的影响..... .........28
2.5.3 共培养时间的影响............... ........... 29
2.6 抗性植株的获得.. 30
2.7 抗性植株的分子检测. ......... 30
讨
论.......... 32
1 花生幼叶植株再生体系的研究. ............. 32
1.1 影响不定芽再生体系因素的研究. ..... 32
1.2 影响体细胞胚再生体系因素的研究. . 32
2 农杆菌介导转化效率因素的研究. ......... 33
2.1 Km 筛选浓度的确定. ............ 33
2.2 预培养时间对转化的影响. . 33
2.3 侵染时间对转化的影响. ..... 33
2.4 共培养对转化的影响. ......... 34
2.5 再生途径对遗传转化的影响. ............. 34
结
论.......... 35
1 花生幼叶植株再生体系的建立. ............. 35
2 农杆菌介导花生遗传转化条件的确立. . 35
3 转几丁质酶基因花生植株的获得 .......... 36
参考文献. ..... 37
附录.............. 41
致谢...........42