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  • 资源分类:生物农医
  • 适用专业:动物遗传育种与繁殖
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资料简介
硕士论文-利用精子载体法制备LTF转基因山羊的初步研究,共56页,27677字
摘 要
精子介导基因转移是以精子为载体,在受精时将外源目的基因导入卵母细
胞,是目前转基因动物研究中简单而高效的方法学之一。乳铁蛋白(LTF)也称
为乳转铁蛋白,是一种铁结合蛋白,广泛分布于多种组织、细胞内,具有非特异
性免疫、参与铁代谢和细胞生长调节等功能。本试验主要研究了在精子介导基因
转移过程中精子与外源结合的影响因素,并对利用精子载体法制备LTF转基因山
羊进行了初步研究。
精子与外源 DNA 共孵育后,精子结合外源 DNA 的效率就成为精子介导转
基因法成功的关键。本研究以 DIG 标记的 EGFP 作为示踪基因来检测精子结合
外源 DNA 的影响因素,用考马斯亮蓝染色技术评价精子的顶体反应。结果显示:
山羊精子能够自发的结合外源 DNA,而且,最初的结合部位在精子外膜的顶体
后区。在检查的 27 只公羊样本中,结合率在 3.2%-48.4%,不同供体的精子结合
外源 DNA 的能力有显著差异(p<0.01)。同一山羊的精子分别在 17℃、27℃、
37℃条件下,与外源 DNA 共孵育。结果表明:精子与外源 DNA 的结合率随共
孵育时间的延长而增加。在 27℃和 37℃下,孵育 60 分钟后的结合率不再增加,
同样的结果出现在 17℃处理了 90 分钟的试验组里。为获得高转染率,分别对
EGF、Insulin、肝素和 ITS 四种因子对精子结合外源 DNA 的影响也进行了评价。
结果表明:用添加 10 ng/ml EGF 的 BO 液能显著提高转染率(试验组 30.5%,对
照组 19.4%),但精子获能的比率变化不大。相似的结果出现在 Insulin 和肝素处
理的组里。用 ITS 的最终浓度(0.5%-5%)评价其促进 DNA 与精子的结合能力。
在 0.5%ITS 组,试验组(0.5%,16.2%;1%,12.0%;2%,9.5%;5%,9.4%)和对照
组(21.9%)外源 DNA 的转染率显著不同。精子获能率在 5% ITS 试验组和对照
组差异显著(64.7%vs.86.2%),但其他试验组差异不显著(0.5%,87.9%;1%,
85.7%;2%,82.7%)。此外,EGF(10 ng/ml)、Insulin(5 μg/ml)和肝素(10 μg/ml)
对 DNA 转染的比率也进行了评价,试验组和对照组有明显差异(27.9% vs.19.3%)
( p<0.05 )。然而,BO 液添加 LipefectaminTM -2000 抑制三个因子对山羊精子转
染外源 DNA 的促进作用(22.1% vs.27.9%)(p<0.05)。
对 70 只母羊进行同期发情处理,其中有 26 只发情,发情率为 37.1%。精子
与 LTF 基因共孵育后,对 62 只母羊进行人工授精,共产生后代 26 只,经过 PCR
检测 LTF 阳性后代有 2 只,阳性率为 7.7%,试验结果证明了精子介导法制备转
基因山羊的可行性。
关键词:外源 DNA;精子;转染;获能;山羊;LTF
目 录
中文摘要........
英文摘要........
英文缩写词表
前 言.....
文献综述........
精子载体法转基因研究概述......
精子结合外源 DNA 的分子机制........
精子内化转运外源 DNA 的分子机制...
精子介导转基因方法学进展......
4.1 体外精子介导法.....
精子与外源 DNA 的共孵育…......
脂质体包裹 DNA 转染精子.
电穿孔法.....
显微注射受精法(ICSI).....
限制性内切酶介导法(REMI)...
单克隆抗体 C 介导法..
4.2 体内精子介导法.....
精子与外源 DNA 结合的影响因素.......
精子介导转基因研究成果.
LTF 的生物学效应及研究进展...
结语.
研究内容........
第一部分 山羊精子与外源 DNA 结合的影响因素分析.......
试验材料……....
1.1 试验动物........
1.2 试验试剂........
1.3 试验仪器........
试验方法..
2.1 外源 DNA pEGFP-N1 的准备.
2.2 精子转染试验
2.3 试验设计........
结果.
pEGFP-N1 质粒鉴定及纯化....
3.2 不同山羊精子与 DNA 结合率比较.
3.3 精子孵育温度及外源 DNA 作用时间的确定...
3.4 脂质体及 DMSO 对外源 DNA 结合的影响......
EGF 对精子获能及 DNA 结合的影响......
Insulin 对精子获能及 DNA 结合的影响...
ITS 对精子获能及 DNA 结合的影响........
3.8 肝素对精子获能及 DNA 结合的影响......
3.9 脂质体与 EGF、Insulin、肝素混合对精子获能及 DNA 结合的影响........
讨论.
4.1 利用考马斯亮蓝染色技术评价体外受精液对精子获能的效果.
4.2 不同山羊个体与外源 DNA 结合率比较..
4.3 精子孵育温度及外源 DNA 作用时间的确定...
4.4 脂质体及 DMSO 对外源 DNA 结合的影响.....
EGF、Insulin、ITS、肝素对外源 DNA 结合的影响........
4.6 精子载体法存在的主要问题..
小结
第二部分 精子介导法制备转基因山羊的研究
试验材料.
1.1 试验动物.......
1.2 试验试剂.......
1.3 试验仪器.......
试验方法.
2.1 公羊的筛选...
2.2 母羊的同期发情处理.....
2.3 精子转染与人工授精.....
2.4 后代山羊的 PCR 检验....
结果.
3.1 公羊的筛选....
3.2 母羊的同期发情及人工授精...
3.3 人工授精后代的生产......
3.4 后代 PCR 检测结果........
讨论
4.1 公羊的筛选...
4.2 母羊的同期发情及人工授精后代的生产
4.3 后代 PCR 检测结果........
小结.
全文结论
参考文献
附录........
致谢........
个人简介........
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